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畢赤酵母表達(dá)時(shí)的雜蛋白問(wèn)題 已有2人參與
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我最近構(gòu)建畢赤酵母X-33工程菌表達(dá)干擾素（20KD左右），搖瓶用BMMY表達(dá)時(shí)，蛋白很純，沒(méi)有40KD以上的蛋白，但是上罐后用基礎(chǔ)鹽離子培養(yǎng)基發(fā)酵后雜蛋白很多；之前還做過(guò)甘露聚糖酶（47KD左右）的表達(dá)，用基礎(chǔ)鹽離子上罐發(fā)酵時(shí)，表達(dá)蛋白很純，沒(méi)有雜蛋白。甘露聚糖酶和干擾素所用的穿梭質(zhì)粒和畢赤酵母菌種完全相同，發(fā)酵工藝也相同。搞不清楚表達(dá)干擾素時(shí)，為何搖瓶表達(dá)沒(méi)有雜蛋白，但是上罐后雜蛋白很多，而上罐表達(dá)甘露聚糖酶時(shí)，相同的發(fā)酵工藝，卻沒(méi)有雜蛋白，這種現(xiàn)象是由于菌體死亡造成的，還是和表達(dá)的蛋白有關(guān)？如果由于菌體自溶造成的，如何調(diào)整發(fā)酵工藝�。壳蟠笊裰更c(diǎn)！ 附上蛋白電泳圖，一張是干擾素的發(fā)酵罐表達(dá)，一張是甘露聚糖酶的發(fā)酵罐表達(dá)。 干擾素發(fā)酵罐表達(dá).jpg 甘露聚糖酶發(fā)酵罐表達(dá).jpg |
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3樓2014-01-23 08:29:01
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【答案】應(yīng)助回帖
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看你的描述和電泳圖，都是胞外表達(dá)，直接發(fā)酵液上清上樣是吧？組成型還是誘導(dǎo)型表達(dá)？用的BMMY和鹽培養(yǎng)基，應(yīng)該是誘導(dǎo)型，需要看你的質(zhì)粒圖譜（標(biāo)明各元件即可）還有發(fā)酵大體步驟。 初步推斷：畢赤酵母表達(dá)外源蛋白時(shí)，會(huì)有不同程度的糖基化現(xiàn)象，上罐進(jìn)行高密度發(fā)酵的糖基化現(xiàn)象肯定比搖瓶要明顯很多。另外，你的產(chǎn)物電泳顯示有雜蛋白，建議進(jìn)行2個(gè)實(shí)驗(yàn)，western blot和酶活測(cè)試。 還有畢赤酵母的上罐可能不能較頻繁，所以建議多做幾罐比較下結(jié)果。 上述5個(gè)問(wèn)題的情況能夠詳細(xì)描述的話，問(wèn)題應(yīng)該能夠確定。 |
4樓2014-01-26 12:14:39
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5樓2014-01-26 12:17:40
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是直接上的發(fā)酵上清跑的電泳；質(zhì)粒用的是PICZαA；發(fā)酵過(guò)程大概是上罐后36~42小時(shí)左右甘油補(bǔ)料長(zhǎng)生物量，之后是甲醇誘導(dǎo)，甲醇補(bǔ)料速度先慢后快，根據(jù)溶氧控制補(bǔ)料速度，溶氧控制在30%左右。干擾素序列中有一個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，但糖基化對(duì)蛋白分子量的影響應(yīng)該不會(huì)特別大吧。上面干擾素電泳圖中，40KD以上的都是雜蛋白，不同的泳道是不同發(fā)酵時(shí)間取的樣品。干擾素這個(gè)菌種我也上過(guò)很多次罐了，都有雜蛋白，估計(jì)這雜蛋白很有可能是菌體死亡后產(chǎn)生的，但是發(fā)酵工藝與甘露聚糖酶的大致相同，不知為何會(huì)出現(xiàn)這種狀況。你說(shuō)的酶活性和干擾素活性都能檢測(cè)出來(lái)，但是干擾素有雜蛋白，使后面的純化還要過(guò)離子交換柱什么的，就比較麻煩。 |
6樓2014-02-02 16:04:39
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7樓2014-02-10 23:21:46
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蛋白在菌體內(nèi)折疊修飾是耗氧過(guò)程，溶氧不足會(huì)影響蛋白活性，這個(gè)我在做甘露聚糖酶發(fā)酵時(shí)溶氧是否充足活性變化很明顯，而且看很多文獻(xiàn)基本上都把溶氧控制在20%-50%。在補(bǔ)料過(guò)程中通富氧空氣，蠕動(dòng)泵一工作補(bǔ)甲醇，溶氧就開(kāi)始下降，當(dāng)溶氧升到50%左右時(shí)開(kāi)始下一次補(bǔ)料，這個(gè)過(guò)程時(shí)間不是很長(zhǎng)，會(huì)因?yàn)樘荚床粔蛟斐删w死亡么？ 開(kāi)始誘導(dǎo)后發(fā)酵液的OD值我倒是沒(méi)測(cè)過(guò)，我是用濕菌重來(lái)衡量，濕菌重達(dá)到200 mg/mL左右時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)期生物量也在增長(zhǎng)，但比較緩慢，最后能達(dá)到濕菌重350 mg/mL左右。是不是在誘導(dǎo)階段控制生物量維持恒定會(huì)比較好？估計(jì)雜蛋白是菌體死亡裂解出來(lái)的，很多文獻(xiàn)里酵母表達(dá)的蛋白電泳圖中都含有40KD以上的雜蛋白，這或許是種普遍現(xiàn)象？像我做的甘露聚糖酶這種雜蛋白很少的情況可能比較特殊，就是搞不明白是怎么造成的…… 太客氣了，還沒(méi)感謝你參與討論呢…… |
8樓2014-02-11 11:31:40
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9樓2014-02-13 00:04:39
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10樓2014-02-13 09:03:30
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