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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 畢赤酵母表達一直不表達
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XUMIN6891金蟲 (初入文壇)
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畢赤酵母表達一直不表達 已有2人參與
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| 大家好，我是一個做酵母表達的初學者，我現(xiàn)在做了好久了結果一直沒表達，現(xiàn)敘述過程如下：我用PCR鑒定正確已成功整合到酵母基因組的菌落進行表達，我先用YPDS培養(yǎng)基搖正確的菌落大致?lián)u23h左右，然后按1%的比例接種到25ml BMGY培養(yǎng)基中的，然后搖24h左右OD值大致是2.7-2.8之間，我用4000r離心10分鐘，棄上清，然后用我預先配好的100ml BMMY培養(yǎng)基其中的一部分把上述菌體先懸浮，然后全部加到BMMY培養(yǎng)基中開始誘導表達，按1%的補加甲醇量每24h補加一次，每24h取一次樣，前2天我是每次取1ml，到96h-168h我都是取得10ml，然后我用TCA方法進行濃縮的，我是做個梯度分別用的是1ml，3ml，5ml上清來進行濃縮的，然后最后加到上樣量用SDS-PAGE法進行鑒定，我的蛋白大小時15KD左右，用的是考馬斯亮藍染色法然后進行脫色，結果條帶還是幾乎跟看不到似的，哪位高手指導一下我哪步需要改進，哪步做的有問題嗎？不甚感謝哦！ |
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