 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 3715 | 回復(fù): 13 | |||||
| 本帖產(chǎn)生 1 個(gè) MolEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | |||||
XUMIN6891金蟲(chóng) (初入文壇)
|
[求助]
畢赤酵母表達(dá)一直不表達(dá) 已有2人參與
|
||||
| 大家好，我是一個(gè)做酵母表達(dá)的初學(xué)者，我現(xiàn)在做了好久了結(jié)果一直沒(méi)表達(dá)，現(xiàn)敘述過(guò)程如下：我用PCR鑒定正確已成功整合到酵母基因組的菌落進(jìn)行表達(dá)，我先用YPDS培養(yǎng)基搖正確的菌落大致?lián)u23h左右，然后按1%的比例接種到25ml BMGY培養(yǎng)基中的，然后搖24h左右OD值大致是2.7-2.8之間，我用4000r離心10分鐘，棄上清，然后用我預(yù)先配好的100ml BMMY培養(yǎng)基其中的一部分把上述菌體先懸浮，然后全部加到BMMY培養(yǎng)基中開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)，按1%的補(bǔ)加甲醇量每24h補(bǔ)加一次，每24h取一次樣，前2天我是每次取1ml，到96h-168h我都是取得10ml，然后我用TCA方法進(jìn)行濃縮的，我是做個(gè)梯度分別用的是1ml，3ml，5ml上清來(lái)進(jìn)行濃縮的，然后最后加到上樣量用SDS-PAGE法進(jìn)行鑒定，我的蛋白大小時(shí)15KD左右，用的是考馬斯亮藍(lán)染色法然后進(jìn)行脫色，結(jié)果條帶還是幾乎跟看不到似的，哪位高手指導(dǎo)一下我哪步需要改進(jìn)，哪步做的有問(wèn)題嗎？不甚感謝哦！ |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專(zhuān)輯推薦
 【分子生物】EPI帖 | 酵母表達(dá)純化一站式解決！ | 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有62人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專(zhuān)業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 畢赤酵母表達(dá)問(wèn)題求教
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 關(guān)于畢赤酵母表達(dá)
已經(jīng)有22人回復(fù)
- 111
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 表達(dá)后的畢赤酵母培養(yǎng)
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 畢赤酵母表達(dá)
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 畢赤酵母表達(dá)出蛋白但沒(méi)有活性
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 畢赤酵母表達(dá)的蛋白無(wú)活性
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 請(qǐng)教個(gè)畢赤酵母表達(dá)的問(wèn)題
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 畢赤酵母轉(zhuǎn)化表達(dá)
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 【求助/交流】用畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K表達(dá)蛋白時(shí)分子量的估計(jì)？
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 畢赤酵母怎么表達(dá)不出融合蛋白？
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助/交流】請(qǐng)教關(guān)于畢赤酵母表達(dá)外源基因
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【求助/交流】畢赤酵母胞外表達(dá)上清無(wú)活性，但胞內(nèi)測(cè)得活性，WHY?
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】畢赤酵母表達(dá)胞外蛋白，sds電泳后看不到條帶
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】畢赤酵母表達(dá)蛋白的奇怪現(xiàn)象
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【分享】精心收集的關(guān)于畢赤酵母表達(dá)的專(zhuān)題，多多支持哈！
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【求助/交流】畢赤酵母表達(dá)相關(guān)問(wèn)題
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 畢赤酵母表達(dá)（總是整合不上）
已經(jīng)有17人回復(fù)
爨鄉(xiāng)主人
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 18 (小學(xué)生)
- 金幣: 4048.1
- 散金: 82
- 紅花: 22
- 帖子: 594
- 在線: 138.3小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 3238985
- 注冊(cè): 2014-05-28
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 數(shù)論
12樓2014-10-27 20:15:18
dshlove
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- MolEPI: 17
- 應(yīng)助: 237 (大學(xué)生)
- 金幣: 4764.7
- 散金: 20
- 紅花: 10
- 帖子: 852
- 在線: 419.2小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1609389
- 注冊(cè): 2012-02-10
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 污染控制化學(xué)
2樓2012-09-05 15:16:56
dshlove
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- MolEPI: 17
- 應(yīng)助: 237 (大學(xué)生)
- 金幣: 4764.7
- 散金: 20
- 紅花: 10
- 帖子: 852
- 在線: 419.2小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1609389
- 注冊(cè): 2012-02-10
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 污染控制化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 幾個(gè)帖子一起給予EPI，謝謝對(duì)分子版的支持 2012-09-06 13:49:31
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 幾個(gè)帖子一起給予EPI，謝謝對(duì)分子版的支持 2012-09-06 13:49:31
|
我們篩選30個(gè)，但是最終鑒定正確的卻不多哦，當(dāng)然也分批次去表達(dá)測(cè)試。一次弄不過(guò)來(lái)這么多，不像是大腸桿菌啊。 我覺(jué)得上清的量是次要因素，主要是你的蛋白濃度決定的。 我們一般是用硫酸銨沉淀，不過(guò)硫酸銨沉淀要求蛋白濃度是1mg/ml,但是硫酸銨在蛋白的穩(wěn)定性方面還是很好的�？茨愕牡鞍紫袷墙到饬�，若蛋白濃度不高此方法僅供參考。 如果你的蛋白濃度低的話，我給一種方法，參考下： 以1ml上清為例，1ml上清加0.1ml 0.15%DOC， 室溫放置10min， 在加入50ul 100%TCA。 這種方法適合蛋白濃度小于1ug/ml的低濃度情況下，注意，不要有SDS哦。 希望能幫上。  |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
XUMIN68916樓2012-09-06 10:09:22
dshlove
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- MolEPI: 17
- 應(yīng)助: 237 (大學(xué)生)
- 金幣: 4764.7
- 散金: 20
- 紅花: 10
- 帖子: 852
- 在線: 419.2小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1609389
- 注冊(cè): 2012-02-10
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 污染控制化學(xué)
8樓2012-09-06 10:29:05
XUMIN6891
金蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1015.5
- 帖子: 41
- 在線: 19.1小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1127506
- 注冊(cè): 2010-10-20
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 獸醫(yī)傳染病學(xué)
|
因?yàn)槲覀冞@的電轉(zhuǎn)移不是太好只能設(shè)個(gè)電壓和時(shí)間并且電壓最高是1100v時(shí)間也只能設(shè)4ms，，所以電轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞GS115后，就只長(zhǎng)11個(gè)菌落，然后依次把它分區(qū)點(diǎn)種到200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml博萊霉素板上，我第一次做所以就先挑了8個(gè)，提酵母DNA鑒定都正確，但是做完表達(dá)后最多用5ml的上清進(jìn)行TCA濃縮，裂解后的沉淀我也跑了條帶也不是太亮，如果我要做WB，我用那個(gè)his單抗行不行，因?yàn)槲疫@個(gè)蛋白沒(méi)有特異性的抗體，你們一般篩選多少個(gè)轉(zhuǎn)化子�。� |
3樓2012-09-06 08:13:57
dshlove
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- MolEPI: 17
- 應(yīng)助: 237 (大學(xué)生)
- 金幣: 4764.7
- 散金: 20
- 紅花: 10
- 帖子: 852
- 在線: 419.2小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1609389
- 注冊(cè): 2012-02-10
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 污染控制化學(xué)
4樓2012-09-06 08:44:57
XUMIN6891
金蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1015.5
- 帖子: 41
- 在線: 19.1小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1127506
- 注冊(cè): 2010-10-20
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 獸醫(yī)傳染病學(xué)
|
是的，我覺(jué)得我電轉(zhuǎn)化效率低的原因可能與電轉(zhuǎn)儀有很大關(guān)系，雖然少但是長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行鑒定也都是正確的也都整合到酵母基因組當(dāng)中了啊，像你們一般篩選30多個(gè)，如果這30多個(gè)鑒定都正確的話，你都進(jìn)行表達(dá)了��？應(yīng)該是分批進(jìn)行表達(dá)的，一次不可能做這么多把？還有個(gè)問(wèn)題是你一般對(duì)收集的樣品進(jìn)行TCA濃縮的時(shí)候，最多用過(guò)多少量的上清進(jìn)行濃縮啊，我最多用的是5ml，還是不太明顯但似乎又有點(diǎn)條帶！我也不知道該怎么辦！給指導(dǎo)一下把！ |
5樓2012-09-06 09:42:21
XUMIN6891
金蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1015.5
- 帖子: 41
- 在線: 19.1小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1127506
- 注冊(cè): 2010-10-20
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 獸醫(yī)傳染病學(xué)
7樓2012-09-06 10:21:44
ptzhyding06
銅蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 7 (幼兒園)
- 金幣: 441.6
- 帖子: 38
- 在線: 59.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 927513
- 注冊(cè): 2009-12-14
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 生物化工與食品化工
9樓2013-04-14 18:38:16
小科研女dow
木蟲(chóng) (小有名氣)
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 21 (小學(xué)生)
- 金幣: 3823.2
- 散金: 20
- 紅花: 2
- 帖子: 187
- 在線: 163.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2112648
- 注冊(cè): 2012-11-07
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 環(huán)境微生物學(xué)
10樓2013-04-30 11:19:40
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 XUMIN6891 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 284求調(diào)劑 +4 | Zhao anqi 2026-03-22 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑 +5 | 上岸6666@ 2026-03-20 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 305分求調(diào)劑（食品工程） +4 | Sxy112 2026-03-21 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +3 | 26研0 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料學(xué)碩301分求調(diào)劑 +7 | Liyouyumairs 2026-03-21 | 7/350 |
|
|
[考研] 初試 317 +7 | 半拉月丙 2026-03-20 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 279求調(diào)劑 +5 | 紅衣隱官 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +6 | Mqqqqqq 2026-03-19 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 083200學(xué)碩321分一志愿暨南大學(xué)求調(diào)劑 +3 | innocenceF 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +6 | 曼殊2266 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿西南交大，求調(diào)劑 +5 | 材化逐夢(mèng)人 2026-03-18 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 南京大學(xué)化學(xué)376求調(diào)劑 +3 | hisfailed 2026-03-19 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +3 | 阿姐阿姐家啊 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 329求調(diào)劑 +9 | 想上學(xué)吖吖 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 中南大學(xué)化學(xué)學(xué)碩337求調(diào)劑 +3 | niko- 2026-03-19 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 北科281學(xué)碩材料求調(diào)劑 +5 | tcxiaoxx 2026-03-20 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 【同濟(jì)軟件】軟件（085405）考研求調(diào)劑 +3 | 2026eternal 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085601專(zhuān)碩，總分342求調(diào)劑，地區(qū)不限 +5 | share_joy 2026-03-16 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料，紡織，生物（0856、0710），化學(xué)招生啦 +3 | Eember. 2026-03-17 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 277調(diào)劑 +5 | 自由煎餅果子 2026-03-16 | 6/300 |
|