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兔兔yy070330銅蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
畢赤酵母表達(dá)出蛋白但沒(méi)有活性
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各位大蝦，小妹最近用畢赤酵母KM71和GS115表達(dá)一個(gè)水解酶，該酶在原始菌中是分泌表達(dá)的。我利用的是pPIC9K質(zhì)粒，構(gòu)建的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進(jìn)兩個(gè)宿主，取空的pPIC9K質(zhì)粒電轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞作為陰性對(duì)照。另外在涂板的時(shí)候我把制備的感受態(tài)細(xì)胞也涂了MD板，沒(méi)有長(zhǎng)出來(lái)，感受態(tài)應(yīng)該是沒(méi)有問(wèn)題。我是直接用1mg/ml的G418 MD板進(jìn)行篩選陽(yáng)性菌落，，過(guò)了48小時(shí)左右長(zhǎng)出菌落，是白色的，形態(tài)也很像酵母。將這些菌落接入含有1mg/ml的G418 MD液體培養(yǎng)基，提取基因組用通用引物AOX3'、AOX5'和自己的特異性引物進(jìn)行PCR都擴(kuò)出了條帶，大小也和目的基因大小相當(dāng)。之后接種到BMGY培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到BMMY培養(yǎng)基，每天補(bǔ)加甲醇至終濃度為1%，之后每天取樣測(cè)酶活，第6天的時(shí)候取上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，有表達(dá)條帶，大小也和預(yù)測(cè)的目的蛋白大小相當(dāng)。但就是沒(méi)有活性。做了80%硫酸銨沉淀，仍然沒(méi)有活性。 最近老板催的緊，壓力很大。請(qǐng)各位幫我分析分析，我的操作有沒(méi)有什么問(wèn)題，大恩不言謝  |
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