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lemonilove銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
重組PCR驗(yàn)證時(shí)沒(méi)有目的條帶
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進(jìn)行基因A和基因B進(jìn)行重組PCR后，瓊脂糖核酸電泳發(fā)現(xiàn)存在目的條帶，但是也有很多非特異性的條帶，切膠回收后用距離最遠(yuǎn)的兩端的引物PCR驗(yàn)證，核酸電泳后只在100-250bp之間有很亮的條帶，而目標(biāo)位置沒(méi)有條帶，求解決辦法! A基因 B基因 重組PCR驗(yàn)證 [ Last edited by lemonilove on 2011-7-26 at 21:59 ] |
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 【分子生物】EPI帖 |
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anlewo7777
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 方法二很新穎 2011-07-26 22:48:21
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 方法二很新穎 2011-07-26 22:48:21
| 我以前也遇到過(guò)這種情況，有兩個(gè)辦法：一個(gè)是，按原來(lái)的體系多做點(diǎn)，合并之后切膠回收，這樣得到你的目標(biāo)條帶；另一個(gè)是配100ul的體系，模板用注射器針頭在做好的目標(biāo)條帶位置扎一下，用針筒吹進(jìn)PCR體系里作為模板，同時(shí)降低退火溫度擴(kuò)增一下試試。這兩個(gè)方法你可以試試看哪個(gè)可以走通。另外，有必要仔細(xì)檢查一下你的兩端引物是不是對(duì)，別弄錯(cuò)了。 |
2樓2011-07-26 22:06:33
空谷幽風(fēng)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 重組PCR是做出來(lái)了，但是再擴(kuò)增就沒(méi)有了呢。降低退火溫度和換方法都可以考慮。 2011-07-26 22:50:09
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 重組PCR是做出來(lái)了，但是再擴(kuò)增就沒(méi)有了呢。降低退火溫度和換方法都可以考慮。 2011-07-26 22:50:09
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你的B基因擴(kuò)完后有兩條非常量的帶，不知道你的A,B基因以及B圖中擴(kuò)出來(lái)的片段各是多大？至于重組PCR沒(méi)擴(kuò)出目的條帶給你的建議是： （1）檢查overlap有多長(zhǎng)，最好在15bp以上，能達(dá)到20bp就更好了 （2）選取你擴(kuò)A,B基因時(shí)最低的那個(gè)退火溫度來(lái)擴(kuò)增 （3）如果兩個(gè)方案都不行設(shè)計(jì)酶切連接方案，在A片段的3‘末端和B片段的5’端（以A在前B在后為例）添加BbsI酶切位點(diǎn)（先看看這個(gè)酶怎么用，看懂了再設(shè)計(jì)，實(shí)在看不懂問(wèn)我），先將兩個(gè)片段分別連載體，測(cè)序正確后再將A裝B或B裝A |
3樓2011-07-26 22:41:25
kun2199
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4樓2011-07-31 22:59:26
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