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RT-PCR沒有出現(xiàn)內(nèi)參基因的條帶和目的條帶，請(qǐng)問是什么原因？
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| 最近在做RT-PCR，兩步法的。結(jié)果RNA的質(zhì)量還是可以，三條帶明顯，5s比較淺，但是沒有目的條帶和內(nèi)參的基因的出現(xiàn)，pcr用的是Taq酶，擴(kuò)增的片段是350bp，280bp，360bp，三種基因條帶，結(jié)果沒有出現(xiàn)任何帶，用1.8%瓊脂糖凝膠電泳。我想向大家請(qǐng)教一下是不是用的Taq酶保真性不高所致？還是模板質(zhì)量還是不高？還是用瓊脂糖電泳跑小片段不合適，用聚丙烯酰胺比較合適呢？？？ |
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我是從以下幾個(gè)方面做起。 1. 從基礎(chǔ)做起，把藍(lán)，黃，百槍頭，EP管等實(shí)驗(yàn)器材徹底處理，保證槍頭里面充滿DEPC水，這樣可以將槍頭徹底處理，保證沒有RNA酶；操作時(shí)候要在干凈地方，帶手套和口罩。RNA提取的純度和完整性是最重要的。 2.我更換了RNA提取試劑，換成了TaKaRa的RNA提取試劑，一開始用的是國產(chǎn)的，但覺得不怎么樣。逆轉(zhuǎn)錄酶用Promega的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。按照說明操做。 3.RT成功與否是用內(nèi)參引物做PCR，看看能不能擴(kuò)增出內(nèi)參來驗(yàn)證。擴(kuò)增出，表明成功，否則，不成功。 4.PCR后跑膠用的上樣緩沖液最好是購買的，我們買的是TaKaRa的6X loading buffer。不要用自己配制的。這個(gè)也挺重要的。 |
9樓2013-01-27 16:52:07
wtyyyyy1988
鐵桿木蟲 (正式寫手)
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2樓2012-08-09 20:48:45
3樓2012-08-10 09:58:00
chenguestc
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-08-10 13:54:07
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你的PCR產(chǎn)物跟瓊脂糖濃度無關(guān)，不論哪個(gè)濃度，至少應(yīng)該有帶或許帶是SMEAR不是非常SHARP. 原因1，反轉(zhuǎn)錄過程出了問題，2，PCR組分出了問題。 如果是1，請(qǐng)重新做反轉(zhuǎn)錄。如果是2，請(qǐng)把所有PCR組分全部換成新的。 建議您，先把PCR所有組分換成新的之后看結(jié)果再確定。如果換了全新的組分仍然擴(kuò)增不出來，就只有重新做反轉(zhuǎn)錄。因?yàn)槟愕膬?nèi)參也沒擴(kuò)增出來，排除引物的問題。 |
4樓2012-08-10 12:25:42
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