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liuyu_sdili木蟲 (正式寫手)
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[求助]
求助：一端為黏性末端一端為平末端的克隆 已有1人參與
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需要做一個一端為黏性末端一端為平末端的克隆，求教下面幾個問題？ 1. 如果我用pfu擴增的話，那么是不是可以使用pfu擴增形成的平末端而不用加產(chǎn)生平末端的酶切位點？ 2. 我使用的兩個限制酶都購自Takara，一個是SnaB I，另外一個是NotI，請問這兩個酶使用時需要注意什么？ 3.酶是Fermentas的T4連接酶，說明書上是22℃反應，但是很多人用16℃跟4℃，請問那個效果好些？需要連接多長時間？像我這種情況是不是需要用平末端的連接條件（加入PEG）？ |
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liuyu_sdili
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2樓2012-08-16 18:29:25
mitocam
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+5, 鼓勵積極應助，解答問題 2012-08-17 13:48:19
liuyu_sdili: 金幣+4, ★★★很有幫助, 謝謝 交流經(jīng)驗 2012-08-17 15:35:16
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需要做一個一端為黏性末端一端為平末端的克隆，求教下面幾個問題？ 1. 如果我用pfu擴增的話，那么是不是可以使用pfu擴增形成的平末端而不用加產(chǎn)生平末端的酶切位點？ 理論上可以，但不知DNA聚合酶擴增時會不會丟失一兩個堿基。可以試一試。 2. 我使用的兩個限制酶都購自Takara，一個是SnaB I，另外一個是NotI，請問這兩個酶使用時需要注意什么？ 沒用過SnaBI，NotI是常用酶，按照說明書就行了。 用對buffer能否同時使用兩個酶，他們的實用溫度一樣不？ 3.酶是Fermentas的T4連接酶，說明書上是22℃反應，但是很多人用16℃跟4℃，請問那個效果好些？需要連接多長時間？像我這種情況是不是需要用平末端的連接條件（加入PEG）？ 我用NEB的T4，通常25倍稀釋在水中（短時間）用于連接，通常室溫 23C過夜，如果著急，3－4小時也可以。我一直都有用PEG。 這種情況需要載體去磷酸化嗎？ 不用。 |
3樓2012-08-16 21:26:10
qiaoxianying
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liuyu_sdili
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aofeng860308
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感謝參與，應助指數(shù) +1
liuyu_sdili: 金幣+5, ★★★★★最佳答案, 謝謝，過來人說話就是不一樣~~~ 2012-08-18 20:16:11
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵積極應助，解答問題 2012-08-20 13:43:26
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前兩個月剛做過一平一粘的連接，和樓主分享一下。 1、pfu出來的就是平末端，所以個人覺得不需要在加入酶切位點。 2、takara上有關于兩種酶的buffer選擇問題，不過我沒有找到SnaBI和NotI雙酶切的相關資料。不過這兩個酶切都需要加BSA的。 3、fermentas的T4 ligase22℃連接效果很好，我做的時候是使用22℃2個小時做的一平一粘的連接，加入PEG了的。再不行可以4℃過夜，再22℃連接2小時試試。 |
8樓2012-08-18 19:17:39
liuyu_sdili
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10樓2014-03-25 19:42:07
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