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特異性Promoter引物該怎么設(shè)計(jì)啊
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小弟想請(qǐng)教各位高賢大仙一個(gè)關(guān)于Promoter引物設(shè)計(jì)的問(wèn)題。 我想把在某一種細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因的Promoter擴(kuò)增出來(lái)，然后連接在適當(dāng)?shù)妮d體上并加上標(biāo)記蛋白和熒光蛋白的表達(dá)序列，使這些目的蛋白依據(jù)Promoter的特異性表達(dá)在這種細(xì)胞中。但是小弟之前沒有做過(guò)Promoter引物的設(shè)計(jì)，據(jù)說(shuō)涉及到5‘UTR端的長(zhǎng)度等問(wèn)題，希望各路高人指點(diǎn)一二，不勝感激。 |
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tiani_tan
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張虎: 金幣+5, ★有幫助 2012-08-24 09:35:05
| 啟動(dòng)子的擴(kuò)增，模板是基因組DNA，需要將基因組DNA酶切后連上接頭，以一個(gè)接頭的序列為引物，目的基因內(nèi)部序列為另一側(cè)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有點(diǎn)類似于RACE，你可以參考一下文獻(xiàn)，或者購(gòu)買相關(guān)的試劑盒��！祝好運(yùn)！ |
2樓2012-08-23 12:26:59
3樓2012-08-23 13:07:56
tiani_tan
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首先，確定你的物種是否已經(jīng)被報(bào)道，如果基因組已經(jīng)知道的話，那么根據(jù)網(wǎng)上的序列設(shè)計(jì)引物，這里需要注意的是分析啟動(dòng)子最低片段是多少；含有順式作用原件的區(qū)域有多長(zhǎng)；含有增強(qiáng)子的序列有多少，可能最后需要獲得幾條大小不同的片段，需要構(gòu)建幾個(gè)載體，一一驗(yàn)證。 對(duì)于基因組未曾報(bào)道的序列，就比較復(fù)雜。就像我上文說(shuō)的，需要用一些限制性內(nèi)切酶將基因組酶切成小片段后，連接接頭，然后利用接頭上的一直序列和基因內(nèi)部序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)，然后擴(kuò)增含有不同區(qū)域的引物，驗(yàn)證功能。 建議還是搜集一下相關(guān)文獻(xiàn)，我只是看過(guò)文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室有人做過(guò)這方面的。但我自己沒有做過(guò)。呵呵！！ |
4樓2012-08-24 09:05:24
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你好，多謝你的回答。 我在文獻(xiàn)上查到某個(gè)基因的promoter時(shí)這么說(shuō)“Reporter gene assay: [str-1::gfp] translational fusion, with 4 kb 5'UTR of str-1 and the first 4 amino acids of the protein.” 請(qǐng)問(wèn)4kb 5'UTR of str-1 是從str-1 的5' CDS區(qū)起始密碼子往前算4kb（就是包括了5'UTR ），還是從 5'UTR之前往前算4kb（就是不包括5'UTR ）？還有，那個(gè)“the first 4 amino acids of the protein”怎么解釋？ 非常感謝！ |
5樓2012-08-24 10:25:49
tiani_tan
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張虎6樓2012-08-24 11:51:46
7樓2012-08-24 12:00:25
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