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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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dxli1988

金蟲(chóng) (小有名氣)

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[求助] 重疊延伸PCR

最近一直在做重疊延伸PCR,獲得第一輪的產(chǎn)物，切膠回收后，在第二輪重疊PCR怎么也做不出來(lái)，個(gè)人覺(jué)得引物沒(méi)有問(wèn)題，重疊22bp，本身基因的GC比就不太正常，含量較低，但引物再重新設(shè)計(jì)的可能性不大，希望各位前輩指點(diǎn)一二。引物序列分別為：
AF: TTAGTTCGGTAGTTGAGGG
AR: ATAACGTTCATTACTTCTCCAGATTTTGTGTCATTC
BF: CTGGAGAAGTAATGAACGTTATTGCAATATTGAATC
BR: TAGCAGTTCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACCTTAACGG
A基因片段長(zhǎng)為535bp，B片段長(zhǎng)為2168bp。
前5個(gè)循環(huán)不加引物，低溫退后，加引物后25循環(huán)。這是其中一次梯度PCR的結(jié)果。

重疊延伸PCR結(jié)果

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逆水行舟，不進(jìn)則退。

1樓 2012-08-26 18:00:14

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chjinzhi

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【答案】應(yīng)助回帖

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amisking: 回帖置頂 2012-08-26 20:41:25
amisking: 金幣+2, 鼓勵(lì)發(fā)帖交流問(wèn)題。 2012-08-26 20:41:30
dxli1988: 金幣+3, ★★★很有幫助 2012-08-26 21:52:37

我現(xiàn)在也在做這類實(shí)驗(yàn)。剛剛無(wú)結(jié)果，原先的時(shí)候和你一樣，都不能擴(kuò)出目的片段，只能得到其中的一條片段。不過(guò)后來(lái)，我請(qǐng)教些前輩，就做出來(lái)了。他們建議我從重疊的片段質(zhì)量入手，所謂片段質(zhì)量指的是你加如反應(yīng)體系的兩片段的摩爾比要是1：1，就拿你的片段來(lái)說(shuō)，如果兩片段的濃度基本一樣，那么二者的體積比就要是4：1（大：�。�；再者就是前五個(gè)循環(huán)里的延伸時(shí)間要足夠，退火溫度要合適！實(shí)在確定不了，就用Touch-down吧！若還是出不來(lái)，嘗試下把循環(huán)數(shù)增加幾個(gè)！

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4樓2012-08-26 19:24:59

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chjinzhi

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【答案】應(yīng)助回帖

引用回帖:

10樓: Originally posted by piaoyunokok at 2012-08-27 11:24:17
恩啊，最近我也在做這個(gè)，兩個(gè)片段大小不同的話，濃度基本一樣，體積比應(yīng)該是片段小的添加量小嗎？...

是的。如果濃度一樣，那二者就是片段大小的反比。如1000bp的片段和500bp的片段，二者體積比就是2:1，就是要保證二者的條數(shù)一樣！

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15樓2012-08-27 21:04:25

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tuodecai

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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-08-27 13:49:17
dxli1988: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-08-27 15:44:41

從技術(shù)上來(lái)講，這不是難題，憑我多年overlapping PCR的經(jīng)驗(yàn)，我拼接過(guò)兩個(gè)5k的片段成11k的。給你點(diǎn)信心！呵呵我建議重疊區(qū)最好稍長(zhǎng)一點(diǎn) 25-30bp，意思就是讓重疊區(qū)的退火溫度高一點(diǎn)，而引物的Tm值稍低一點(diǎn)。套疊PCR最關(guān)鍵的是模板了，一是要純，二是濃度稍高（最好能達(dá)到100-200ng/lu）。其次，改進(jìn)PCR反應(yīng)條件也會(huì)有一定的作用，我常用的是在第一輪在一較高的溫度退火后，72度延伸10min。想當(dāng)初我跟你一樣，曾經(jīng)發(fā)過(guò)很多貼求助套疊PCR，也看過(guò)很多貼，實(shí)驗(yàn)技能這東西還是要不斷的失敗中積累經(jīng)驗(yàn)。祝你早日成功！

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9樓2012-08-27 10:32:42

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aofeng860308

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引用回帖:

5樓: Originally posted by dxli1988 at 2012-08-26 21:54:33
延伸時(shí)間足夠是怎么回事，我在前5個(gè)循環(huán)里延伸5s，因?yàn)橹挥?2bp重合，這樣可以嗎，還有touchdown我也做過(guò)，到底是個(gè)逐漸升溫的過(guò)程還是降溫的過(guò)程呢？...

延伸時(shí)間5s怎么夠？前5個(gè)循環(huán)的作用是什么要搞清楚，延伸是為了得到連接后的總長(zhǎng)度啊，也就是要擴(kuò)2700左右的片段，好歹也得2-3min啊，后面加引物就是以這段全長(zhǎng)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的。以后再做SOE的時(shí)候，一定要保證重合在30bp個(gè)以上，這樣就很好做了！

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7樓2012-08-26 22:02:41

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電泳圖中，前4個(gè)孔不是，后邊的全是。

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2樓2012-08-26 18:01:05

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lishaohe

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膠回收后，再做第二輪PCR的前五個(gè)反應(yīng)可以適當(dāng)延伸一下時(shí)間，就是延伸時(shí)間變長(zhǎng)一些，而且第二輪PCR的退火溫度適當(dāng)再降低一些，延伸時(shí)間3min左右吧，我以前經(jīng)常做重疊PCR，從來(lái)沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)其他問(wèn)題，不過(guò)我的片段總長(zhǎng)在2000bp左右。希望對(duì)你有些幫助。

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3樓2012-08-26 19:02:13

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4樓: Originally posted by chjinzhi at 2012-08-26 19:24:59
我現(xiàn)在也在做這類實(shí)驗(yàn)。剛剛無(wú)結(jié)果，原先的時(shí)候和你一樣，都不能擴(kuò)出目的片段，只能得到其中的一條片段。不過(guò)后來(lái)，我請(qǐng)教些前輩，就做出來(lái)了。他們建議我從重疊的片段質(zhì)量入手，所謂片段質(zhì)量指的是你加如反應(yīng)體系的 ...

延伸時(shí)間足夠是怎么回事，我在前5個(gè)循環(huán)里延伸5s，因?yàn)橹挥?2bp重合，這樣可以嗎，還有touchdown我也做過(guò)，到底是個(gè)逐漸升溫的過(guò)程還是降溫的過(guò)程呢？

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5樓2012-08-26 21:54:33

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3樓: Originally posted by lishaohe at 2012-08-26 19:02:13
膠回收后，再做第二輪PCR的前五個(gè)反應(yīng)可以適當(dāng)延伸一下時(shí)間，就是延伸時(shí)間變長(zhǎng)一些，而且第二輪PCR的退火溫度適當(dāng)再降低一些，延伸時(shí)間3min左右吧，我以前經(jīng)常做重疊PCR，從來(lái)沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)其他問(wèn)題，不過(guò)我的片段總長(zhǎng) ...

前五個(gè)反應(yīng)的延伸時(shí)間怎么算呢？退火溫度也做了梯度，也沒(méi)接過(guò)，我用的pfu,延伸速率為500bp/min，我設(shè)置的延伸時(shí)間為5min，

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6樓2012-08-26 22:01:44

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7樓: Originally posted by aofeng860308 at 2012-08-26 22:02:41
延伸時(shí)間5s怎么夠？前5個(gè)循環(huán)的作用是什么要搞清楚，延伸是為了得到連接后的總長(zhǎng)度啊，也就是要擴(kuò)2700左右的片段，好歹也得2-3min啊，后面加引物就是以這段全長(zhǎng)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的。以后再做SOE的時(shí)候，一定要保證 ...

我的理解是，前5個(gè)反應(yīng)只是負(fù)責(zé)搭橋，這一部分只有重疊的部分反應(yīng)，和全長(zhǎng)有直接的關(guān)系嗎？還有這個(gè)退火溫度是不是按照重疊部分的Tm值來(lái)參考呢？

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8樓2012-08-26 22:15:30

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恩啊，最近我也在做這個(gè)，兩個(gè)片段大小不同的話，濃度基本一樣，體積比應(yīng)該是片段小的添加量小嗎？

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10樓2012-08-27 11:24:17

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