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極糾結(jié)！求高手高手高高手��！實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增正常，為何跑膠始終彌散？
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如題。已糾結(jié)2周多了，這問題。身邊能問的高手都問了，還是沒法子~~ 求點(diǎn)撥！ 左邊marker D2000，前沿為100bp；挨著的倆復(fù)孔熔解曲線有倆峰，已確認(rèn)前者為引物峰，后者當(dāng)為產(chǎn)物峰，但條帶彌散；再往右倆復(fù)孔熔解曲線單峰、峰在后，當(dāng)為產(chǎn)物峰，但彌散；再往右倆復(fù)孔熔解曲線單峰、峰在前，引物二聚體；再往右倆復(fù)孔熔解曲線單峰、峰在前，但擴(kuò)增曲線僅有微微抬頭、引物二聚體。 下圖為對(duì)應(yīng)的熔解曲線圖。 下圖為擴(kuò)增曲線圖。 http:// ![](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/jj3/image3/f6/a8/586686_1346381817_934.jpg#opennewwindow\") 條件及后續(xù)問題排查情況如下： 1、第一循環(huán)起跳，是因?yàn)榍懊嫔凶鲞^一次20循環(huán)的降落PCR、以增加特異。 2、引物為國(guó)際糧農(nóng)組織推薦SSR引物。 3、電泳條件120v，40min，1.2%瓊脂糖凝膠，試過90v，結(jié)果一樣。上樣量2.5uL，試過6uL，結(jié)果一樣。跑膠之前，擴(kuò)增產(chǎn)物UV法測(cè)過dsDNA濃度，大約200ng/uL。多次重復(fù)如此。試過降低引物濃度、可消除引物熒光、但還是彌散。 4、熒光pcr，sybr I（ROX）2倍mix，ABI；7500機(jī)器ABI；引物擴(kuò)增基因250bp左右，GC含量46%50%。Tm值60、62。條件95度20秒、57度40秒、72度1分鐘（之前做過20個(gè)循環(huán)降落PCR66度-57度）。 5、問題排查，做過退火溫度梯度及質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照。質(zhì)�？身樌艹�1000bp條帶，mix和水沒問題。有引物二聚體條帶、降低濃度條帶消失、引物沒問題。但始終有擴(kuò)增曲線、跑膠彌散。降低引物濃度后、退火溫度梯度66度到55度均試了，擴(kuò)增結(jié)束要么沒有、要么引物二聚體、要么彌散、大部分泳道是彌散。 6、模板換成肝組織提取的DNA，情況也如上。 抓狂中…… 求高手高高手指點(diǎn)迷津�。�！感激ing�。。� 2.JPG 3.JPG [ Last edited by 愚人田蕾 on 2012-8-31 at 12:10 ] |
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jjg0912
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)積極交流經(jīng)驗(yàn) 2012-09-01 15:41:24
愚人田蕾: 金幣+2, ★有幫助 2012-09-04 12:16:45
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愚人田蕾: 金幣+2, ★有幫助 2012-09-04 12:16:45
| 從你的定量曲線上看，我感覺你的定量反應(yīng)并不好。我是兩年前做過大量的定量，一般都是第一個(gè)峰（引物峰）要低于第二個(gè)峰（產(chǎn)物峰）。可看圖三并不是這樣，其實(shí)跑膠的結(jié)果也驗(yàn)證了你的懷疑。應(yīng)該是你的定量模板有問題，別的問題你都考慮到了。建議重新反轉(zhuǎn)錄，在做定量前，先做個(gè)普通的pcr反應(yīng)檢測(cè)模板的效果。 |
2樓2012-08-31 23:56:18
xyz_su3樓2012-09-04 12:15:28
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本帖內(nèi)容被屏蔽 |
4樓2013-10-18 23:47:20
5樓2018-04-15 17:09:12
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