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chs4502金蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助帶酶切位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)
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我想將我的目的片段連接到PYeS 2載體中，但是我的我的目的片段的GC含量很高，超過了60%。以cDNA為模版的PCR一直跑不出來。希望蟲友們幫我設(shè)計(jì)一對(duì)帶酶切位點(diǎn)的引物。MCS參照PYeS 2載體。 5端：ATGTGCCAGGGACAGGCAGTCCAGGGTCTGAGGCGCCGGAGTTCATTCTTGAAGCTC…………TGGCTACTGGCACCTATCGTGTGCTGCAGCGCCTGGCAGACGTGGCAGCTGAGGCCTAG3端。 PS：最后不要加保護(hù)堿基了，否則引物的Tm就要超標(biāo)了。 |
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2樓2012-09-27 12:46:01
cicelyzh
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3樓2012-09-27 13:12:37
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-09-27 14:04:29
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-09-27 14:04:29
| 引物設(shè)計(jì)沒有教科書上說的那么嚴(yán)格，這個(gè)完全可以自己設(shè)計(jì)，保護(hù)堿基一定要加的，否則是不能識(shí)別兩端的酶切位點(diǎn)的，這個(gè)一定要記住。而且GC含量高也不要緊的，退火溫度可以到60，如果P不出來的話還可以用高GC的PCR啊，有專門的高GC buffer，這個(gè)你可以自己查查。TM超標(biāo)什么的都是浮云，做多了你就知道了，我還用過50多bp的primer做PCR呢，絕對(duì)可以的。 |
4樓2012-09-27 13:47:01
houchm0927
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流經(jīng)驗(yàn) 2012-09-28 14:42:04
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流經(jīng)驗(yàn) 2012-09-28 14:42:04
| 具體理論不多說，說點(diǎn)自己做過的，僅供參考。設(shè)計(jì)引物時(shí)GC含量57-60%經(jīng)常有，Tm60也做過，可以用。保護(hù)堿基曾有過沒加的經(jīng)歷，沒問題，有時(shí)加保護(hù)堿基也不是按理論上的堿基（當(dāng)然別形成新的酶切位點(diǎn)），也沒問題。總之，我跟人認(rèn)為一般PCR引物設(shè)計(jì)沒有那么嚴(yán)格。另外聲明，我的模板都是質(zhì)粒，不知道以cDNA為模板會(huì)如何。 |
5樓2012-09-27 20:42:42
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