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酶切問(wèn)題求助
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最近將PET-32a轉(zhuǎn)化BL21，轉(zhuǎn)進(jìn)去后挑了5個(gè)單菌落，然后小提質(zhì)粒酶切鑒定。但是酶切的結(jié)果是切不出任何的條帶，并且轉(zhuǎn)化之前的PET-32a質(zhì)粒酶切切出了大小正確的條帶。這說(shuō)明我的體系是沒(méi)有問(wèn)題的，那為什么挑取的這5個(gè)菌落，小提質(zhì)粒酶切卻切不出來(lái)東西呢？大家?guī)兔Ψ治鱿拢x謝 P.S 我用的是天根的質(zhì)粒小提試劑盒 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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額，看了上面的回答有點(diǎn)無(wú)語(yǔ)，樓主注意一下一下幾點(diǎn)： 1 首先檢查感受態(tài)質(zhì)量，建議做一個(gè)對(duì)照試驗(yàn)，找個(gè)以前能轉(zhuǎn)化出來(lái)的質(zhì)粒作對(duì)照。 2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化只需要加1微升足以，至于步驟嚴(yán)格按照傳統(tǒng)方法進(jìn)行，另外需要說(shuō)明的是，PET系列載體是原核表達(dá)載體，拷貝數(shù)比一般質(zhì)粒要低很多，轉(zhuǎn)化前最好測(cè)一下質(zhì)粒濃度，保證有50ng轉(zhuǎn)化就行了。 3 還是拷貝數(shù)的問(wèn)題，由于PET載體的特殊性，提取質(zhì)粒收菌要非常多，一般小提收菌要在6毫升以上，而且菌液還要濃一些，就這樣，提取的質(zhì)粒濃度都不是非常大，所以也有可能是收菌太少導(dǎo)致質(zhì)粒濃度過(guò)低看不出條帶。 4 轉(zhuǎn)化過(guò)程本身一般不會(huì)有問(wèn)題，容易有問(wèn)題的就是感受態(tài)和抗生素，還是建議做對(duì)照來(lái)排除這兩個(gè)因素。 |
11樓2012-09-05 11:24:13
windsor2011
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-09-05 14:00:24
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轉(zhuǎn)化之前的PET-32a質(zhì)粒酶切切出了大小正確的條帶,那只是說(shuō)明你的質(zhì)粒沒(méi)問(wèn)題，但不能說(shuō)明你的體系沒(méi)問(wèn)題。而你轉(zhuǎn)化之后酶切卻沒(méi)條帶，這說(shuō)明你或許沒(méi)有轉(zhuǎn)化進(jìn)去，如果確定轉(zhuǎn)化進(jìn)去了，那你就要真的考慮你的酶切體系是否正確，如果體系合理，那酶切結(jié)果會(huì)理想的。祝好運(yùn)。 |
2樓2012-09-04 15:23:24
dshlove
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9樓2012-09-05 08:40:23
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10樓2012-09-05 10:41:15
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