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linxi185856新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
我的PCR結(jié)果讓我郁悶了啊，有圖有真像……
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圖中是用RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行的PCR，我的目的條帶在740bp，引物設(shè)計(jì)的時(shí)候，是沒(méi)有引物二聚體的，退火溫度是在低于TM值4度，變性45s，延伸45s；30個(gè)循環(huán)。可是出來(lái)的確實(shí)這樣的情況，請(qǐng)各位大俠幫助分析下，到底是什么情況？ 1_副本_副本.jpg |
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-09-07 13:46:01
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-09-07 13:46:01
| 1樓的建議很好，稀釋模板，用巢式PCR方法都可以有效增加目的產(chǎn)物，另外引物設(shè)計(jì)并非只是避免引物二聚體就可以了，因?yàn)镽T后CDNA比較復(fù)雜，模板并不單一，因而引物要求要比以質(zhì)粒為模板時(shí)的PCR要高，盡量要避免錯(cuò)配等情況發(fā)生，另外引物設(shè)計(jì)自由能也要從5‘-3’端整體趨勢(shì)降低，這樣有利于引物退火。建議做梯度PCR摸索最佳退火溫度，如果一輪不行用巢式PCR擴(kuò)增，還有就是好好分析一下引物，提高引物的質(zhì)量。 |
3樓2012-09-07 10:11:42
【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+5, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-09-07 13:45:40
linxi185856: 金幣+1, ★★★★★最佳答案, 謝謝，我再改變引物等條件嘗試下 2012-09-12 21:20:16
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小丹木木: 金幣+5, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-09-07 13:45:40
linxi185856: 金幣+1, ★★★★★最佳答案, 謝謝，我再改變引物等條件嘗試下 2012-09-12 21:20:16
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產(chǎn)生大分子量的彌散條帶，大多數(shù)情況下是由于退火溫度過(guò)低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的。 建議：可將將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）；另外， 在PCR擴(kuò)增階段，盡可能提高擴(kuò)增用的模板的純度，適當(dāng)提高退火溫度或使用touchdown（二階段溫度法）的方法重新擴(kuò)增；或者設(shè)計(jì)內(nèi)外兩對(duì)引物，采用半巢式或者巢式PCR的擴(kuò)增方法，以提高產(chǎn)物的特異性。 |
2樓2012-09-07 09:41:00
linxi185856
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4樓2012-09-08 17:06:12
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5樓2012-09-08 19:06:27
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流經(jīng)驗(yàn) 2012-09-10 13:47:38
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我上學(xué)期做的PCR結(jié)果與你的結(jié)果 大同小異，我設(shè)過(guò)溫度梯度，稀釋過(guò)模版濃度，都沒(méi)效果。我覺(jué)得應(yīng)該是引物設(shè)計(jì)的不太理想。。 看你的結(jié)果，既然目的序列偏小，可能是引物與非目的序列的cDNA結(jié)合了，建議你將設(shè)計(jì)的引物在genebank里blast一下看看吧 |
6樓2012-09-08 19:08:36
linxi185856
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7樓2012-09-09 12:35:19
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8樓2012-09-09 18:25:21
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9樓2012-09-10 09:11:26
10樓2012-09-10 10:36:46
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