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rodwell新蟲 (初入文壇)
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[求助]
【求助】PGL3-basic載體，連500bp左右的片段，菌落長得很滿，卻都是空載體 已有1人參與
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這個做了兩次，第一次：質(zhì)粒跟目的片段酶切都是37度過夜的，質(zhì)粒也切開了（4800bp處條帶），連接是4度過夜連的（所用T4的說明書上是4度）。轉(zhuǎn)化amp板子之后第二天密密麻麻都是菌落，但是提出來的質(zhì)粒雙切之后只能看到載體條帶，500bp處空空如也，但奇怪的是PCR卻能P出500bp條帶來。 不死心，拿去測序，果然轉(zhuǎn)進(jìn)去的是空質(zhì)粒。 理論上感受態(tài)細(xì)胞只能接受一種質(zhì)粒啊，所以又否決了重組和空載都轉(zhuǎn)進(jìn)去了的猜測。 第二次P完之后先拿去測序，無誤，其他步驟同上，不過多連接了半天，結(jié)果還是一樣，這次連PCR都沒條帶了。 但還是能長出密密麻麻的菌落，然后提出來發(fā)現(xiàn)是空質(zhì)粒。 排查各種情況后，俺認(rèn)為雙酶切按理說不應(yīng)該自連這么嚴(yán)重啊~ 會不會是雙切的時候，有一個酶沒切開？但是Bgl II和Xhol I都是常用酶，還共用H-buffer，這樣看來會不會是其中一個酶失活了？ 帶著這個猜測，我用兩種酶分別單切了質(zhì)粒，再加上一個未切的質(zhì)粒作control，跑出來的結(jié)果是：兩個酶都在4800bp處有條帶，而control由于超螺旋明顯跑到了前面。。。但我留意到其中Xhol I 在大于5K marker的地方，也就是更靠后的地方還有一條帶，俺的問題就在這里：這是不是說嗎Xhol I 有問題？是不是一部分只切開了單鏈？ 另外如果不是酶的問題，這個過程中還會有哪些步驟會導(dǎo)致“克隆很多，卻全是空載體”這種局面呢？ 跪求指導(dǎo)~ |
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xiaofei1712
鐵蟲 (小有名氣)
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