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rodwell新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
【求助】PGL3-basic載體，連500bp左右的片段，菌落長(zhǎng)得很滿(mǎn)，卻都是空載體 已有1人參與
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這個(gè)做了兩次，第一次：質(zhì)粒跟目的片段酶切都是37度過(guò)夜的，質(zhì)粒也切開(kāi)了（4800bp處條帶），連接是4度過(guò)夜連的（所用T4的說(shuō)明書(shū)上是4度）。轉(zhuǎn)化amp板子之后第二天密密麻麻都是菌落，但是提出來(lái)的質(zhì)粒雙切之后只能看到載體條帶，500bp處空空如也，但奇怪的是PCR卻能P出500bp條帶來(lái)。 不死心，拿去測(cè)序，果然轉(zhuǎn)進(jìn)去的是空質(zhì)粒。 理論上感受態(tài)細(xì)胞只能接受一種質(zhì)粒啊，所以又否決了重組和空載都轉(zhuǎn)進(jìn)去了的猜測(cè)。 第二次P完之后先拿去測(cè)序，無(wú)誤，其他步驟同上，不過(guò)多連接了半天，結(jié)果還是一樣，這次連PCR都沒(méi)條帶了。 但還是能長(zhǎng)出密密麻麻的菌落，然后提出來(lái)發(fā)現(xiàn)是空質(zhì)粒。 排查各種情況后，俺認(rèn)為雙酶切按理說(shuō)不應(yīng)該自連這么嚴(yán)重啊~ 會(huì)不會(huì)是雙切的時(shí)候，有一個(gè)酶沒(méi)切開(kāi)？但是Bgl II和Xhol I都是常用酶，還共用H-buffer，這樣看來(lái)會(huì)不會(huì)是其中一個(gè)酶失活了？ 帶著這個(gè)猜測(cè)，我用兩種酶分別單切了質(zhì)粒，再加上一個(gè)未切的質(zhì)粒作control，跑出來(lái)的結(jié)果是：兩個(gè)酶都在4800bp處有條帶，而control由于超螺旋明顯跑到了前面。。。但我留意到其中Xhol I 在大于5K marker的地方，也就是更靠后的地方還有一條帶，俺的問(wèn)題就在這里：這是不是說(shuō)嗎Xhol I 有問(wèn)題？是不是一部分只切開(kāi)了單鏈？ 另外如果不是酶的問(wèn)題，這個(gè)過(guò)程中還會(huì)有哪些步驟會(huì)導(dǎo)致“克隆很多，卻全是空載體”這種局面呢？ 跪求指導(dǎo)~ |
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xiaofei1712
鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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