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頑象銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
western blot 遇到困難 請求幫助�。�！
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最近做western一直不順 希望高手給予幫忙啊 我的目的蛋白是116KDa，51KDa 均是單抗， 內(nèi)參是36KDa， 分離膠10% 濃縮膠是5% 蛋白電泳恒壓50V 50min 90V 60min 三個蛋白一起轉(zhuǎn)膜 恒壓100V 2h 封閉2小時， 一抗、二抗均是1:500稀釋， 一抗37℃搖床孵育1小時 4℃過夜， 二抗37℃搖床孵育1小時 顯出的條帶如圖中： 116的蛋白在最上面 膜背景比較暗，而且出現(xiàn)雜帶（但是我訂購的abcam的說明書上是單抗的）； 51的那個蛋白條帶比較暗，都看不太清楚條帶； 最讓人頭疼的是內(nèi)參（最下面的那個）竟然沒條帶  ； 這中間到底出現(xiàn)了什么原因呢？剛接觸蛋白，做了幾次，結(jié)果都不是很好，很是頭疼，希望各位能給點(diǎn)指導(dǎo)意見，謝謝了！IMG0890A.jpg IMG0891A.jpg |
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新蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
silicare: 金幣+4, 應(yīng)助指數(shù)+1 2012-09-11 10:06:38
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| 哪幾個是你的三個樣？（除了Marker）；電泳的時候沒問題，因?yàn)槟愕腗arker都跑開了；轉(zhuǎn)膜之前你有沒有用麗春紅染色看看蛋白條帶？轉(zhuǎn)膜的電壓比較小，你的Marker都不是很清晰（還是你照相沒照好），按常規(guī)來說，進(jìn)口預(yù)染的Marker應(yīng)該很清晰；轉(zhuǎn)膜的時候是常溫還是在低溫條件下轉(zhuǎn)的？有可能是溫度原因；另外，你的電轉(zhuǎn)液是新配的還是？（如果不是，可以用新的電轉(zhuǎn)液試試）（相對來說，整個背景不深，說明你洗膜沒問題），你試試我說的這些，看看有改變不 |
2樓2012-09-10 10:58:52
頑象
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好的 非常感謝。 用手機(jī)拍的 照片有點(diǎn)模糊，上面有三張膜，我拼在了一起 最上面的一條膜是116KDa，中間是51KDa 最下面是36的內(nèi)參； 轉(zhuǎn)膜前 我用的考馬斯亮藍(lán)染色效果很好的 條帶很清晰， 您說的轉(zhuǎn)膜電壓比較小 我們實(shí)驗(yàn)室做蛋白的都是這個電壓 然后根據(jù)自己的蛋白加長或減少轉(zhuǎn)膜時間，最近看了有些人做恒流轉(zhuǎn)膜 不知道效果怎么樣，marker轉(zhuǎn)膜后還是很清晰的，照相效果不是很好，轉(zhuǎn)膜的時候是在冰上轉(zhuǎn)膜的 儀器裝置全都覆蓋上了冰，電轉(zhuǎn)液這個是新配的， 但是三條膜的背景不是一樣的，是不是封閉不好或者一抗?jié)舛扔悬c(diǎn)大造成的？ |
3樓2012-09-10 15:27:02
linyingjia
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4樓2012-09-11 21:19:03
頑象
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5樓2012-09-11 22:07:30
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6樓2012-09-12 09:09:30
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7樓2012-11-01 12:07:45
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