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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » WB問題
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WB問題
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| 跪求各位大神，我剛開始做WB，我的分子量是80KD是植物核蛋白，提的植物的總蛋白，5% +10%電泳5小時，maker還沒完全跑出濃縮膠，就一起進行80V恒壓濕法轉PVDF0.22膜轉6個小時，轉完后染膠無條帶，轉完后是用的試劑盒，封閉，稀釋抗體，洗膜都是用試劑盒里的blocking buffer（5%脫脂奶粉PBST稀釋），封閉一個小時，洗都洗5次只是每次加的量不多，壓膜曝光2小時，結果背景很深看不到目的帶，maker只看到一條帶,求分析原因 |
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xiaoqi5992
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zds22572樓2012-09-14 16:59:50
3樓2012-09-14 23:52:45
xiaoqi5992
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4樓2012-09-17 08:43:21
david0308
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5樓2012-09-17 13:59:12
6樓2012-09-18 12:42:51
gaorongbest
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【答案】應助回帖
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wizardfan: 金幣+1, 謝謝分享經驗 2012-09-19 05:39:19
wizardfan: 金幣+1, 謝謝分享經驗 2012-09-19 05:39:19
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我們轉膜的時候都是200mA轉膜2.5小時或80mA轉過夜，對應的電壓是不是80V就不清楚了（我只是說說我們的，僅供你參考，排查原因），轉膜結束后先用蘇丹紅染色看是否轉到膜上了（一般Marker用預染的，這樣轉膜后可以看到膠上沒有Marker殘留說明轉到了膜上，不包括轉過了，蘇丹紅染色有條帶說明沒轉過），之后再封閉，2小時，按抗體要求加一抗二抗；你采用什么方式曝光的？一般都是30min內都可以看到了，時間長了背景也染色了，圖片不漂亮。 你的Marker只看到一條，是哪一條？是較大的一條嗎？如果是這樣，就可能是轉膜過了。 希望對你有幫助  |
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7樓2012-09-18 21:10:54
8樓2012-09-18 22:01:59
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