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[求助]
WB問題
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| 跪求各位大神，我剛開始做WB，我的分子量是80KD是植物核蛋白，提的植物的總蛋白，5% +10%電泳5小時，maker還沒完全跑出濃縮膠，就一起進(jìn)行80V恒壓濕法轉(zhuǎn)PVDF0.22膜轉(zhuǎn)6個小時，轉(zhuǎn)完后染膠無條帶，轉(zhuǎn)完后是用的試劑盒，封閉，稀釋抗體，洗膜都是用試劑盒里的blocking buffer（5%脫脂奶粉PBST稀釋），封閉一個小時，洗都洗5次只是每次加的量不多，壓膜曝光2小時，結(jié)果背景很深看不到目的帶，maker只看到一條帶,求分析原因 |
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【答案】應(yīng)助回帖
★
wizardfan: 金幣+1, 謝謝分享經(jīng)驗 2012-09-19 05:39:19
wizardfan: 金幣+1, 謝謝分享經(jīng)驗 2012-09-19 05:39:19
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我們轉(zhuǎn)膜的時候都是200mA轉(zhuǎn)膜2.5小時或80mA轉(zhuǎn)過夜，對應(yīng)的電壓是不是80V就不清楚了（我只是說說我們的，僅供你參考，排查原因），轉(zhuǎn)膜結(jié)束后先用蘇丹紅染色看是否轉(zhuǎn)到膜上了（一般Marker用預(yù)染的，這樣轉(zhuǎn)膜后可以看到膠上沒有Marker殘留說明轉(zhuǎn)到了膜上，不包括轉(zhuǎn)過了，蘇丹紅染色有條帶說明沒轉(zhuǎn)過），之后再封閉，2小時，按抗體要求加一抗二抗；你采用什么方式曝光的？一般都是30min內(nèi)都可以看到了，時間長了背景也染色了，圖片不漂亮。 你的Marker只看到一條，是哪一條？是較大的一條嗎？如果是這樣，就可能是轉(zhuǎn)膜過了。 希望對你有幫助  |
zds2257
7樓2012-09-18 21:10:54
xiaoqi5992
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2樓2012-09-14 16:59:50
3樓2012-09-14 23:52:45
xiaoqi5992
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4樓2012-09-17 08:43:21
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