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有沒有關于植物RT-PCR的詳細步驟
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| 有沒有關于植物RT-PCR實驗的詳細步驟 比如RNA的提取 ， 序列該上什么網站下載來輔助設計引物，RT-PCR的儀器又該如何操作的 因為我是第一次做所以步驟越詳細越好 拜托大家啦 |
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swj11123: 金幣+3, ★有幫助, 謝謝啦 但有沒有專門針對植物的呀植物 2012-09-18 09:08:19
gyfgood: 金幣+10, APEPI+1, 應助指數(shù)+1, 很詳細，很有幫助！ 2012-09-26 12:39:35
swj11123: 金幣+5, ★有幫助 2012-09-26 20:56:16
swj11123: 金幣+7, ★★★★★最佳答案 2012-10-20 10:20:23
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RT-PCR實驗步驟 一．實驗器具： 1.移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl 2.吸頭：1ml、200μl、20μl 3.勻漿管：5ml 4.EP管：1.5ml、500μl、200μl 5.試劑瓶：棕色試劑瓶(廣口，放75%乙醇) 6.量筒：100ml 7.容量瓶：1000ml 8.試管架：5ml、1.5ml、20μl 9.鋁制飯盒：1-2個 10.大瓷缸：1個 11.錫泊紙：一卷 12.卷紙：2卷 13.三角燒瓶：帶蓋，稍大 二．實驗器具處理 1.塑料制品：(包括槍頭、EP管、勻漿管等)先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制 品逐個浸泡其中(注意：小槍頭要充分浸泡，必要時需要針筒打入DEPC水)，過夜后取出(注意： DEPC水很難自然晾干，所以建議先將剛取出的DEPC物品甩干，槍頭裝入槍頭盒后甩干，EP管和 勻漿管裝入飯盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。高壓后烤干備用。如果DEPC處理過的物品時 間已超過一個星期，再次使用前應再次高壓。 2.玻璃制品：泡酸過夜，沖洗干凈，先泡1‰DEPC過夜，再蒙錫紙烤干備用。 3.勻漿器：(包括剪刀、鑷子)先洗凈后，超聲消毒即可(不需要泡DEPC)。 三．試劑配制 1．DEPC水：吸出1mlDEPC放在1000ml容量瓶中加雙蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水， 并充分振蕩混勻備用。 2．75%乙醇：用無水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(DEPC水需先高壓，高壓時注意：1. 裝DEPC水的瓶子在蓋子和瓶之間要放上線頭；2.高壓時間在40-45分鐘，所以水要適當多加一 點；3.高壓結束后，不要強行放氣，要讓壓力自然下降，不然水會噴出)。 3．異丙醇：放入棕色瓶中。 4．氯仿：放入棕色瓶中。 5．瓊脂糖 四．緩沖液配制 1．電泳緩沖液(5×TBE貯存液)：Tris 54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加 蒸溜水至1000ml。使用時，將5×TBE稀釋10倍成0.5×TBE就可以在電泳時使用(工作濃度) 2．上樣緩沖液(6×緩沖液，4℃保存)：0.25%溴酚藍、0.25%二甲苯青FF、30%甘油 五．瓊脂糖凝膠配制 1．1.0%：1.0g瓊脂糖+100ml電泳緩沖液，微波爐加熱至沸騰(如果首次煮膠，一定要煮 透，以不出現(xiàn)泡沫為標志)，熔化的瓊脂物冷卻至60℃時加入10mg/ml溴化乙錠2.5μl，充分混 勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快瓊 脂糖凝固)后現(xiàn)進行電泳。 2．1.5%:同上，將瓊脂糖的量改為1.5g 六．需購置材料 Taq酶(-20度保存)(配10×buffer和MgCl2)：不需要使用高保真Taq酶，一般的就行。個 人感覺天為時代的普通Taq酶就很不錯。 dNTP(4度保存)：向生物公司購買，原裝和分裝均可。 oligo(dT)15(-20度保存)：可以向生物公司購買Invitrogen合成的廉價貨，每支10元，稀 釋后使用(注意稀釋濃度)，也可以購買Promega的原裝貨，稀釋10倍后使用，稀釋液4度保存。 M-MLV(-20度保存)：向生物公司購買，推薦使用Promega的，當然有錢可以購買更好的AMV。 RNasin(-20度保存)：向生物公司購買，推薦使用Promega的，原裝分裝均可。 DEPC(4度保存)：向生物公司購買，5克足矣。 Trizol(4度保存)：有50ml和100ml規(guī)格，按照實驗需要自己購買。國外進口的有 Invitrogen(Trizol)、羅氏(TriPure)、MRC(TriReagent)；國內的也行，天為時代的就不錯。 Marker(4度保存)：按照目的條帶大小購買，推薦使用天為時代的Marker(物美價廉，上樣 2.5ul就很亮了，較3.0ul的Takara同樣品種Marker為亮)，本人很喜歡它的DL2000。 電泳LoadingBuffer(4度保存)：按照配方自己配制，不需要購買(購買的話價格挺貴)。 七．引物合成 1．內參照：GAPDH(452bp)正義：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 反義：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 2．退火溫度計算：2(A+T)+4(G+C)，正反義平均數(shù)，再上下波動4-5度。 3．引物2 OD已足夠，每管1 OD分裝。 4．引物稀釋：加DEPC水量(μl)＝Xnmol/OD(合成的引物管上有標注)×管上所標OD數(shù)(推 薦每管引物為1 OD分裝，合成之前向公司說明這一點，切記��！)×100。最終引物濃度為10pmol /μl。 八．PCR產物電泳 取1-10μl(一般取5μl)PCR產物，加已點在紙上的6×上樣緩沖液，反復吸打混勻后進行電泳， 一般用穩(wěn)壓狀態(tài)進行電泳，100V左右，電泳20-30分鐘，紫外燈下觀察，結果進行掃描保存。 九．注意點：1逆轉錄后應立即冰水浴2RNA抽提前，打開離心機預冷 TRIzol 法抽提總 RNA 組織100mg/細胞1×107 ↓ 加1mlTRIzol ↓ 組織：勻漿(徹底，分幾次打，是勻漿時產生的熱量能散出，后轉至EP管) 細胞：用1ml加樣器吹至液體澄清且無細胞團塊 ↓ 顛倒混勻10下，室溫5分鐘 ↓ 加氯仿1/5體積(0.2ml)(必須按總體積的1/5) ↓ 顛倒混勻10下，室溫5分鐘 ↓ 4℃，離心12000g，15分鐘 ↓ 轉上層水相(約400μl)于另一1.5mlEP管中 ↓ 加等體積異丙醇(約400μl)，混勻室溫10分鐘 ↓ 4℃，離心12000g，10分鐘 ↓ 棄上清 ↓ 加冰預冷的75%乙醇(DEPC水配)1ml ↓ 4℃離心7500g，5分鐘 ↓ 棄上清，空氣干燥5-10分鐘(不能完全干燥) ↓ 溶于DEPC水中 注意：1.RNA若用于核酸轉移應溶解于樣本緩沖液中，否則DEPC溶解。 2.細胞組織加TRIzol勻漿后，可在-60℃放置至少一個月(甚至可一年以上)。 3.RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年。 4.棄上清的操作，我們一般將EP管倒置在平鋪于桌面的卷紙上，吸干。 5.最后一步棄酒精，將RNA溶于DEPC水的操作，我們的做法是：先按4的步驟吸干酒精，其實 這樣還是不徹底的，再將EP管小離心后用20μl小槍頭(DEPC處理過的)吸出多余的酒精。最后 用200μl中槍頭(DEPC處理過的)吸11.5μl(20μl體系，如果是40μl體系則加倍)的DEPC水 至EP管中，吹打助溶，然后轉移至200μl的EP管(這些EP管中可以事先加好Oligo(dT)15，以 節(jié)省槍頭)中。 兩步法 RT-PCR (第一步：逆轉錄反應：20μl體系，如果是40μl體系則加倍) 試劑 RNA Oligo(dT)15 濃度 0.05μg/μl 體積 11.5μl 2μl 終濃度 0.005μg/μl (0.05μg/μlOligo(dT)15為Oligo(dT)15原液稀釋10倍的濃度) ↓ 混勻，離心，70℃5min ↓ 立即冰水浴，稍離心 ↓ 試劑 M-MLVBuffer dNTP RNasin M-MLV 濃度 5× 10mM 40U/μl 200U/μl 體積 4μl 1μl 0.5μl 1μl 終濃度 1× 0.5mM 20μ 200U 總體積20μl ↓ 混勻，離心，42℃60min ↓ 95℃10min(破壞M-MLV) ↓ 4℃保存 (第二步：PCR反應：總體積20μl，如果50μl體系，相應加倍) 試劑 TaqBuffer MgCl2 dNTP 上游引物 下游引物 cDNA模板 DEPC水 Taq酶 濃度 10× 25mM 10mM 10pmol/μl 10pmol/μl 2.5U/μl 體積 2μl 1.2μl 0.2μl 0.4μl 0.4μl 1μl 14.7μl 0.1μl 終濃度 1× 1.5mM ↓ 混勻 ↓ 95℃ 94℃ X℃ 72℃ 72℃ 5分 30秒 30-40秒 30秒 7分 預變性 變性 退火 延伸 終末延伸 (28-36循環(huán)，4℃保存) 注意：1.Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存，操作時置于冰上。 2.dNTP保存在4度即可，勿反復凍融。 3.如果一次做很多管，可以先將共同需要的部分一起加(稍微多算一點，例如20管分裝，可以加 入21-22管的量，因為槍頭會吸附一定的液體，可能有人認為這樣會浪費試劑，其實不然，因為 每管分開加的話試劑用量更多，槍頭吸附的試劑的量其實也是很可觀的，特別是國產的槍頭，這 樣做同時還能降低加樣誤差)，然后各管分裝，再加各自不同的部分。 4.如果200μl的EP管在PCR過程中蓋子容易炸開，解決方法有：(1)用封口膜將管口密封、(2) 最后每管加入液體石蠟進行液封。 |
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swj111232樓2012-09-17 21:33:49
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