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[求助]
載體構(gòu)建 求助
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| 我現(xiàn)在做的是將1400bp的目的片段連接到1301載體上，具體方法是，先將添加了Xbal和BamH1酶切位點的pcr產(chǎn)物與pmd18-T連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，提取質(zhì)粒。用Xbal和BamH1分別雙酶切含有目的片段的質(zhì)粒和1301質(zhì)粒。酶切產(chǎn)物膠回收后用solution1 4度連接過夜，之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)上，可是每次培養(yǎng)基上都不長菌，不知道是不是連接體系有問題，（1：1,1:2，1：1：3,1:4，1:5的體系我都試過，就是不長菌），這個實驗我做了好長時間了，就是不成功，還望哪位仁兄給指點一下。不勝感激！ |
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2樓2012-09-19 15:34:51
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你應(yīng)該將目的片段和載體都用酶切處理好，膠回收之后，算好比例，我一般都是1:10的加。然后T4連接，16℃，1小時就夠了，沒必要過夜連接。做好對照（加純載體，目的基因用水代替）。 將對照和連接后的都轉(zhuǎn)化，涂板。 看看是感受態(tài)原因還是平板原因還是載體或者片段沒處理好。 |
3樓2012-09-19 17:06:14
joan198108
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4樓2012-09-20 10:52:39
【答案】應(yīng)助回帖
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不長菌，首先要考慮的是抗性有沒有用錯，或者1301質(zhì)粒有沒有問題。所以正如第一樓所說的一樣，做一個1301質(zhì)粒的直接轉(zhuǎn)化做對照就可以排除這個問題。 然后。如果對照組長得好的話，說明就是連接的問題了。如果對照組長得少的話，就是感受態(tài)的效率低。如果感受態(tài)效率低的話，也會導致連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化長的菌少甚至不長。 如果上面都沒問題，只是連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化沒長的話，就好好優(yōu)化下連接體系。按照各種說明書來。不過我一般都很隨便的。做雙切連接都很好挑陽性克隆，基本上全是陽性克隆，而且板子長得都還行。連接體系根本不CARE，盡量多加片段就可以了。 |
5樓2012-09-20 13:04:12
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