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zy2012zy新蟲 (初入文壇)
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[求助]
載體構(gòu)建 求助
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| 我現(xiàn)在做的是將1400bp的目的片段連接到1301載體上，具體方法是，先將添加了Xbal和BamH1酶切位點(diǎn)的pcr產(chǎn)物與pmd18-T連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒。用Xbal和BamH1分別雙酶切含有目的片段的質(zhì)粒和1301質(zhì)粒。酶切產(chǎn)物膠回收后用solution1 4度連接過(guò)夜，之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)上，可是每次培養(yǎng)基上都不長(zhǎng)菌，不知道是不是連接體系有問(wèn)題，（1：1,1:2，1：1：3,1:4，1:5的體系我都試過(guò)，就是不長(zhǎng)菌），這個(gè)實(shí)驗(yàn)我做了好長(zhǎng)時(shí)間了，就是不成功，還望哪位仁兄給指點(diǎn)一下。不勝感激！ |
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joan198108
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4樓2012-09-20 10:52:39
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2樓2012-09-19 15:34:51
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
看天: 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 常來(lái) 2012-09-20 13:40:22
zy2012zy: 回帖置頂 2012-09-30 10:22:53
zy2012zy: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-11-16 12:37:08
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zy2012zy: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-11-16 12:37:08
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你應(yīng)該將目的片段和載體都用酶切處理好，膠回收之后，算好比例，我一般都是1:10的加。然后T4連接，16℃，1小時(shí)就夠了，沒(méi)必要過(guò)夜連接。做好對(duì)照（加純載體，目的基因用水代替）。 將對(duì)照和連接后的都轉(zhuǎn)化，涂板。 看看是感受態(tài)原因還是平板原因還是載體或者片段沒(méi)處理好。 |
3樓2012-09-19 17:06:14
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
看天: 金幣+5, 鼓勵(lì)交流和分享 2012-09-20 13:41:47
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不長(zhǎng)菌，首先要考慮的是抗性有沒(méi)有用錯(cuò)，或者1301質(zhì)粒有沒(méi)有問(wèn)題。所以正如第一樓所說(shuō)的一樣，做一個(gè)1301質(zhì)粒的直接轉(zhuǎn)化做對(duì)照就可以排除這個(gè)問(wèn)題。 然后。如果對(duì)照組長(zhǎng)得好的話，說(shuō)明就是連接的問(wèn)題了。如果對(duì)照組長(zhǎng)得少的話，就是感受態(tài)的效率低。如果感受態(tài)效率低的話，也會(huì)導(dǎo)致連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化長(zhǎng)的菌少甚至不長(zhǎng)。 如果上面都沒(méi)問(wèn)題，只是連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化沒(méi)長(zhǎng)的話，就好好優(yōu)化下連接體系。按照各種說(shuō)明書來(lái)。不過(guò)我一般都很隨便的。做雙切連接都很好挑陽(yáng)性克隆，基本上全是陽(yáng)性克隆，而且板子長(zhǎng)得都還行。連接體系根本不CARE，盡量多加片段就可以了。 |
5樓2012-09-20 13:04:12
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