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connieba新蟲 (小有名氣)
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[求助]
全式金的pEASY-EI載體和目的基因連不上
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| 做了很多次了，大小2.7kb的目的基因一直連不上pEASY-E1載體。感受態(tài)和載體確定都沒有問題，步驟也完全按照說明書上的做的。轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)后涂Amp平板，能長出單菌落，但是挑取單菌落做菌落PCR都呈陰性。實(shí)在是找不到原因了，望好心人幫助~是實(shí)驗(yàn)手法的問題嗎？之前也做過連接1.8Kb目的基因的，很順利的就連上了~ |
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atlanticwi
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流經(jīng)驗(yàn) 2012-09-21 14:26:39
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流經(jīng)驗(yàn) 2012-09-21 14:26:39
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嗯...................... 這個(gè)pEASY-E1是T載體嗎？是的話先確保A尾。2.7K有些大了，其他都沒有問題的話，試下延長連接時(shí)間，過夜較好，并確保2.7K的回收條帶純度高。 實(shí)在不行，就換載體，推薦Promega的pGEM-T，我3.6K多的基因一連一個(gè)準(zhǔn)。有時(shí)候選擇貴一點(diǎn)的東西是沒錯(cuò)的，不要貪圖便宜方便。 個(gè)人看法 若有說錯(cuò)請高手指點(diǎn)  |
2樓2012-09-21 13:52:28
connieba
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3樓2012-09-21 14:02:47
atlanticwi
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4樓2012-09-21 15:27:34
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5樓2012-09-22 14:34:59
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6樓2012-10-25 16:44:07
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沒有哦，現(xiàn)在就直接放棄這個(gè)方法了……找不到問題出在哪里~希望你能解決問題啦…… 7樓2012-10-27 13:51:48
summergca
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