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celia2012銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
PCR反應(yīng)體系 已有1人參與
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最近在做RTPCR，做對(duì)照的總是在30個(gè)循環(huán)做樣出現(xiàn)CT值，總覺得是污染了，試了各種方法還是這樣，懷疑有引物二聚體產(chǎn)生，請(qǐng)問反應(yīng)體系中如果模板濃度叫高，是加大引物量還是減少， 之前做的反應(yīng)體系為：SYBR MIX:10UL 引物：0.8ul 水：7.4微升 做338f-518r引物CT值大概在12,13左，模板濃度較高，如何優(yōu)化體系 |
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gwd0312
木蟲 (正式寫手)
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2樓2012-09-24 18:47:59
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
celia2012: 金幣+4 2012-09-25 13:07:11
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
celia2012: 金幣+4 2012-09-25 13:07:11
| 你的問題不是很清楚。如果你覺得你用做反轉(zhuǎn)錄的RNA有DNA污染，需要優(yōu)化DNase消化的條件。反轉(zhuǎn)錄時(shí)做負(fù)對(duì)照，用于檢測(cè)RNA樣品中的痕量DNA污染。至于你說的模板濃度較高，你可以根據(jù)情況稀釋。我一般是用1ug RNA做反轉(zhuǎn)錄，稀釋5倍后取1ul做PCR。這只是一般而言，豐度很高或者很低的mRNA要根據(jù)情況稀釋。還有你給出了引物的體積，不知道你用的引物濃度多少。一般RTPCR采用終濃度為0.2-0.5uM。如果你認(rèn)為有引物二聚體產(chǎn)生，可以適當(dāng)降低引物濃度。 |
3樓2012-09-25 07:17:52
mamadexiao
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4樓2012-09-25 15:47:36
mao19881205
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5樓2012-09-25 15:49:17
6樓2019-02-03 09:50:18
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