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zhuifeng7000

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[求助] 求助：用BacterioMatch®II Two-Hybrid System對(duì)兩個(gè)蛋白進(jìn)行細(xì)菌雙雜交已有2人參與

1、如題，不知有誰(shuí)用過這個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌雙雜交的實(shí)驗(yàn)？
2、XL1-Blue MRF´ Kan這個(gè)菌有三株，其實(shí)當(dāng)驗(yàn)證兩個(gè)特定的蛋白是否有相互作用時(shí)，是否用其中的任意一株都可以的？
3、如果兩個(gè)蛋白確實(shí)是有相互作用的，在板上應(yīng)該菌體應(yīng)該長(zhǎng)成什么樣子？做到最后一步涂板后我的陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照還有目的菌長(zhǎng)的都很小，菌體是否會(huì)長(zhǎng)的比較大一點(diǎn)？是否會(huì)像DH5a或者Top10過夜在板上生長(zhǎng)的樣子？
謝謝！

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1樓 2012-09-28 10:29:27

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11ychen

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
zhuifeng7000: 金幣+5, ★有幫助, 感謝交流~ 2012-11-01 23:09:23
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)積極交流經(jīng)驗(yàn) 2012-11-02 13:35:12

我之前也是做細(xì)菌雙雜交的，XL1-Blue MRF´ Kan這個(gè)菌只是用于前期載體構(gòu)建使用的，不可用于來兩種蛋白相互作用的篩選，進(jìn)行該步驟使用的是reporter competent cell。如果兩種蛋白相互作用的話，在3-AT平板上可以長(zhǎng)出一些單菌落，使用引物pBT F/R and pTRG F/R擴(kuò)增時(shí)，是可以擴(kuò)增出相應(yīng)條帶的。培養(yǎng)時(shí)間是需要很長(zhǎng)（40h），不過結(jié)果還是可行的。不過它的菌落形態(tài)與DH5a不同。

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2樓2012-11-01 11:35:14

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zhuifeng7000

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2樓: Originally posted by 11ychen at 2012-11-01 11:35:14
我之前也是做細(xì)菌雙雜交的，XL1-Blue MRF´ Kan這個(gè)菌只是用于前期載體構(gòu)建使用的，不可用于來兩種蛋白相互作用的篩選，進(jìn)行該步驟使用的是reporter competent cell。如果兩種蛋白相互作用的話，在3-AT平板 ...

我開始也有這個(gè)懷疑，但是我看了公司的protocol后發(fā)現(xiàn)其實(shí)XL1-Blue MRF這個(gè)菌的基因型和reporter competent cell是一模一樣的，只不多不同的菌轉(zhuǎn)化效率不同，其他的似乎沒什么區(qū)別，從原理上來說的話只要激活報(bào)告系統(tǒng)就可以生長(zhǎng)，XL1-Blue MRF也是含有報(bào)告系統(tǒng)的，所以我覺得用這個(gè)菌做后面的驗(yàn)證應(yīng)該也沒有問題吧？
非常感謝交流~

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3樓2012-11-01 23:08:59

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3樓: Originally posted by zhuifeng7000 at 2012-11-01 23:08:59
我開始也有這個(gè)懷疑，但是我看了公司的protocol后發(fā)現(xiàn)其實(shí)XL1-Blue MRF這個(gè)菌的基因型和reporter competent cell是一模一樣的，只不多不同的菌轉(zhuǎn)化效率不同，其他的似乎沒什么區(qū)別，從原理上來說的話只要激活報(bào)告系 ...

這個(gè)我個(gè)人覺得還是有問題的，不知道你有沒有嘗試對(duì)XL1-Blue MRF進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，我有試過，不知道是自己試驗(yàn)出問題了，還是本來就不可用于雙雜家？當(dāng)用引物擴(kuò)增時(shí)，只有一種對(duì)應(yīng)的蛋白條帶出現(xiàn)？所以還是建議使用reporter cell。能否分享一下這些菌的基因型。謝謝！

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4樓2012-11-03 19:45:14

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xiaodi1010

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myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰，手有余香。分子生物期待更詳細(xì)的解答 2013-09-30 09:03:16

XL1-Blue MRF這個(gè)菌的基因型和reporter competent cell是不一樣的。
有個(gè)問題想請(qǐng)教一下：我現(xiàn)在用這個(gè)系統(tǒng)做互作，陽(yáng)性和陰性control都很好，但是檢測(cè)相互作用都是陰性結(jié)果。而且驗(yàn)證文獻(xiàn)報(bào)道的互作也是陰性結(jié)果。這個(gè)很令人費(fèi)解。可以調(diào)整的條件試過很多。。。

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5樓2013-06-05 19:33:11

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5樓: Originally posted by xiaodi1010 at 2013-06-05 19:33:11
XL1-Blue MRF這個(gè)菌的基因型和reporter competent cell是不一樣的。
有個(gè)問題想請(qǐng)教一下：我現(xiàn)在用這個(gè)系統(tǒng)做互作，陽(yáng)性和陰性control都很好，但是檢測(cè)相互作用都是陰性結(jié)果。而且驗(yàn)證文獻(xiàn)報(bào)道的互作也是陰性結(jié)果 ...

如果control都很好，文獻(xiàn)報(bào)道的互作和你用的是相同的方法的話，我覺得最大的可能性是文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)有問題，而不是你的問題。如果用的不是相同的方法，有可能是因?yàn)椴挥玫南到y(tǒng)的敏感性及對(duì)于不同相互作用的的檢測(cè)偏好性不同引起的，你可以嘗試其他方法試一試。

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6樓2013-06-06 09:21:16

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呂隨意

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★
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-09-30 09:03:25

你好，我也想做幾個(gè)基因的細(xì)菌雙雜，但是載體什么的不知道哪里買，問了幾家都是賣做文庫(kù)的試劑盒，很貴，感覺買了用一點(diǎn)不合算，不知道你的這些都是那邊買的？謝謝，期待回復(fù)

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7樓2013-09-29 22:30:08

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引用回帖:

7樓: Originally posted by 呂隨意 at 2013-09-29 22:30:08
你好，我也想做幾個(gè)基因的細(xì)菌雙雜，但是載體什么的不知道哪里買，問了幾家都是賣做文庫(kù)的試劑盒，很貴，感覺買了用一點(diǎn)不合算，不知道你的這些都是那邊買的？謝謝，期待回復(fù)

我們這邊的是老板問交大要的

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8樓2013-09-30 08:47:15

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★ ★ ★ ★ ★
zhuifeng7000: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-12-30 08:57:44

以下是兩種菌的遺傳背景，我認(rèn)為還是不同的。我有嘗試用兩種菌同時(shí)實(shí)驗(yàn)，用XL1-Blue MRF‘ Kan菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，連陰性control都可以長(zhǎng)。
Validation Reporter Cells ：
Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173
endA1 hisB supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F′ laqIq HIS3 aadA Kanr]

XL1-Blue MRF′ Kan ：
Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F′ proAB lacIqZΔM15 Tn5 (Kanr)].

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9樓2013-12-27 17:01:09

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引用回帖:

9樓: Originally posted by xiaodi1010 at 2013-12-27 17:01:09
以下是兩種菌的遺傳背景，我認(rèn)為還是不同的。我有嘗試用兩種菌同時(shí)實(shí)驗(yàn)，用XL1-Blue MRF‘ Kan菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，連陰性control都可以長(zhǎng)。
Validation Reporter Cells ：
Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173
end ...

看基因型上面的沒有問題，但是我用下面的菌也做出來了，所以應(yīng)該也沒有問題的。非常感謝~

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10樓2013-12-30 08:57:34

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