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yiyijiayou21新蟲 (初入文壇)
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定點(diǎn)突變PCR的有關(guān)問題
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剛開始做定點(diǎn)突變這個實(shí)驗，遇到很多的問題，還請有經(jīng)驗的童鞋們多多幫忙，不勝感激！ 用DpnI酶切時間需要一個小時那么久嗎？我看的說明書上說只需要5分鐘，試劑盒是買的Quick change的！但是，按照說明書上做下來并沒有長出菌落，想問一下做過的童鞋，你們一般做轉(zhuǎn)化時用的感受態(tài)一般是多少啊，這個說明書上說45μl，總感覺少了點(diǎn)！而且熱激的時間是30s，以往我做的一些克隆實(shí)驗都是用的90s�。吭谧鰪�(fù)蘇菌體時要求用NZYM培養(yǎng)基，我這沒有現(xiàn)成的，就用了LB代替啊？結(jié)果基本上都看不到菌落！還想問一下，轉(zhuǎn)化之前先加入巰基乙醇的作用是什么啊？有必要這樣做嗎？ 問題很多，還望用經(jīng)驗的童鞋能幫忙解答一下�。≈x謝謝謝謝！ |
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cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵應(yīng)助 2012-10-15 13:40:32
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| 有些限制性內(nèi)切酶是time saver qualified enzyme，1ul酶可以在5分鐘消化1ugDNA，比如你說的DpnI。雖然如此，我個人還是建議做1-2小時。轉(zhuǎn)化一般使用50-100ul的感受態(tài)細(xì)胞。熱激的最佳時間根據(jù)不同感受態(tài)細(xì)胞不一樣。如果你買的是盒子，公司都做了不同熱激時間的轉(zhuǎn)化效率，說明30s已經(jīng)可以達(dá)到很好的效果，用protocol上面說的沒問題。如果你實(shí)在不放心，可以多加10s。你說的90S是針對按傳統(tǒng)方法自制的感受態(tài)細(xì)胞，效率沒有公司做的高。復(fù)蘇菌是用rich培養(yǎng)液是為了給菌一個更好的環(huán)境，用LB代替是沒問題的。加巰基乙醇是為了增加轉(zhuǎn)化效率，做不做沒有太大關(guān)系。 |
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yiyijiayou212樓2012-10-13 08:32:56
yiyijiayou21
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謝謝謝謝，感謝指導(dǎo)！第一次做，問題很多！ 3樓2012-10-14 22:10:07
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