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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 定點突變PCR的有關問題
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yiyijiayou21新蟲 (初入文壇)
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[求助]
定點突變PCR的有關問題
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剛開始做定點突變這個實驗，遇到很多的問題，還請有經驗的童鞋們多多幫忙，不勝感激！ 用DpnI酶切時間需要一個小時那么久嗎？我看的說明書上說只需要5分鐘，試劑盒是買的Quick change的！但是，按照說明書上做下來并沒有長出菌落，想問一下做過的童鞋，你們一般做轉化時用的感受態(tài)一般是多少啊，這個說明書上說45μl，總感覺少了點！而且熱激的時間是30s，以往我做的一些克隆實驗都是用的90s啊？在做復蘇菌體時要求用NZYM培養(yǎng)基，我這沒有現(xiàn)成的，就用了LB代替��？結果基本上都看不到菌落！還想問一下，轉化之前先加入巰基乙醇的作用是什么��？有必要這樣做嗎？ 問題很多，還望用經驗的童鞋能幫忙解答一下�。≈x謝謝謝謝！ |
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yiyijiayou21
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謝謝謝謝，感謝指導！第一次做，問題很多！ 
3樓2012-10-14 22:10:07
cicelyzh
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數 +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵應助 2012-10-15 13:40:32
感謝參與，應助指數 +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵應助 2012-10-15 13:40:32
| 有些限制性內切酶是time saver qualified enzyme，1ul酶可以在5分鐘消化1ugDNA，比如你說的DpnI。雖然如此，我個人還是建議做1-2小時。轉化一般使用50-100ul的感受態(tài)細胞。熱激的最佳時間根據不同感受態(tài)細胞不一樣。如果你買的是盒子，公司都做了不同熱激時間的轉化效率，說明30s已經可以達到很好的效果，用protocol上面說的沒問題。如果你實在不放心，可以多加10s。你說的90S是針對按傳統(tǒng)方法自制的感受態(tài)細胞，效率沒有公司做的高。復蘇菌是用rich培養(yǎng)液是為了給菌一個更好的環(huán)境，用LB代替是沒問題的。加巰基乙醇是為了增加轉化效率，做不做沒有太大關系。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
2樓2012-10-13 08:32:56
大衛(wèi)·李
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4樓2015-12-07 10:52:50
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