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yiyijiayou21新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
定點(diǎn)突變PCR的有關(guān)問(wèn)題
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剛開(kāi)始做定點(diǎn)突變這個(gè)實(shí)驗(yàn)，遇到很多的問(wèn)題，還請(qǐng)有經(jīng)驗(yàn)的童鞋們多多幫忙，不勝感激！ 用DpnI酶切時(shí)間需要一個(gè)小時(shí)那么久嗎？我看的說(shuō)明書(shū)上說(shuō)只需要5分鐘，試劑盒是買(mǎi)的Quick change的！但是，按照說(shuō)明書(shū)上做下來(lái)并沒(méi)有長(zhǎng)出菌落，想問(wèn)一下做過(guò)的童鞋，你們一般做轉(zhuǎn)化時(shí)用的感受態(tài)一般是多少啊，這個(gè)說(shuō)明書(shū)上說(shuō)45μl，總感覺(jué)少了點(diǎn)！而且熱激的時(shí)間是30s，以往我做的一些克隆實(shí)驗(yàn)都是用的90s��？在做復(fù)蘇菌體時(shí)要求用NZYM培養(yǎng)基，我這沒(méi)有現(xiàn)成的，就用了LB代替啊？結(jié)果基本上都看不到菌落！還想問(wèn)一下，轉(zhuǎn)化之前先加入巰基乙醇的作用是什么�。坑斜匾@樣做嗎？ 問(wèn)題很多，還望用經(jīng)驗(yàn)的童鞋能幫忙解答一下��！謝謝謝謝謝！ |
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大衛(wèi)·李
鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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4樓2015-12-07 10:52:50
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-10-15 13:40:32
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-10-15 13:40:32
| 有些限制性內(nèi)切酶是time saver qualified enzyme，1ul酶可以在5分鐘消化1ugDNA，比如你說(shuō)的DpnI。雖然如此，我個(gè)人還是建議做1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)化一般使用50-100ul的感受態(tài)細(xì)胞。熱激的最佳時(shí)間根據(jù)不同感受態(tài)細(xì)胞不一樣。如果你買(mǎi)的是盒子，公司都做了不同熱激時(shí)間的轉(zhuǎn)化效率，說(shuō)明30s已經(jīng)可以達(dá)到很好的效果，用protocol上面說(shuō)的沒(méi)問(wèn)題。如果你實(shí)在不放心，可以多加10s。你說(shuō)的90S是針對(duì)按傳統(tǒng)方法自制的感受態(tài)細(xì)胞，效率沒(méi)有公司做的高。復(fù)蘇菌是用rich培養(yǎng)液是為了給菌一個(gè)更好的環(huán)境，用LB代替是沒(méi)問(wèn)題的。加巰基乙醇是為了增加轉(zhuǎn)化效率，做不做沒(méi)有太大關(guān)系。 |
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yiyijiayou212樓2012-10-13 08:32:56
yiyijiayou21
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謝謝謝謝，感謝指導(dǎo)！第一次做，問(wèn)題很多！ 3樓2012-10-14 22:10:07
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