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shenxing325銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
請問RT-PCR的過程會產生插入、缺失、突變等情況嗎？
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跟各位請教一下： 第一次提RNA做RT-PCR，反轉錄用的酶是promega的M-MLV，PCR用的酶是Takara的高保真酶PrimeSTAR，然后用rTag酶72度處理了30min加A尾，最后轉進T載體里面。如圖所示，是T載體轉化后的菌落PCR圖，感覺幾個條帶的位置都稍有差異，所以選取了3、4、5三個較濃、大小有代表性的菌落搖菌然后測序。過程大致就是這樣。 結果讓我奇怪的是這三個里面只有一個是我要的目的基因（5號），另外兩個，其中一個（3號）發(fā)生了一些插入和缺失，有一大段和模板比對本來應該是在偏上游的位置，結果整段缺失，在偏下游的位置卻出現(xiàn)了，并且多出了一個堿基，導致后面的序列都移碼了；另外一個（4號）更加奇怪，幾乎沒有完整的orf除了上游引物部分對得上，后面的就完全不是我要的東西了，在NCBI上blast了一下，只有一個序列約有60%不到的堿基能比對得上，是屬于比較近源的物種里面的。 我想弄明白的是，這兩段奇怪序列是從哪里來的，是在反轉錄的時候發(fā)生的插入、缺失和突變嗎？為何還能得到我本來想要的序列？有勞各位！ @Y7KQ[%20`D[Q$(49ILNSUW_副本.jpg |
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