|
|
★ ★ ★ ★
805085868(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵交流 2012-10-22 13:35:30
首先生物信息學(xué)分析，主要涉及調(diào)控蛋白及對應(yīng)結(jié)合部位的DNA
代謝調(diào)控的啟動子結(jié)構(gòu)分析
1)基因敲除, 突變子的篩選
2)調(diào)控蛋白的純化
3)EMSA(Electroforetic Mobility Shift Analyses)實(shí)驗(yàn)鑒定調(diào)控蛋白的結(jié)合區(qū):將純化后的調(diào)控蛋白用不同的濃度與預(yù)測啟動子DNA進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn), 觀察DNA的遷移率確定結(jié)合的區(qū)域。
4)對調(diào)控蛋白所調(diào)控的區(qū)域進(jìn)行點(diǎn)突變:設(shè)計(jì)含有不同的突變點(diǎn)的引物, 通過overlap-extension PCR 得到含有突變的調(diào)控蛋白編碼基因, 以及含有突變的啟動子區(qū)域; 將突變后的蛋白克隆到表達(dá)載體上, 純化后分別與啟動子作用, 鑒定調(diào)控蛋白以及啟動子的保守區(qū)域.
5)啟動子區(qū)域的克隆以及啟動子活性的分析：PCR擴(kuò)增預(yù)測的啟動子區(qū)域而得到不同區(qū)域的片段; 將其連接到含有報告基因lacZ 的無啟動子載體上, 通過檢測b-半乳糖苷酶活性來檢測啟動子的強(qiáng)弱。
6)確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn):
7)RT-PCR確定調(diào)控蛋白調(diào)控的操縱子轉(zhuǎn)錄是否是一個轉(zhuǎn)錄單位 |
|
回復(fù)此樓
一志愿廈門大學(xué)化學(xué)學(xué)碩307求調(diào)劑
+10
5+4