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weining1203新蟲 (小有名氣)
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[求助]
雙酶切質(zhì)粒濃度問題
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| 小弟最近要做雙酶切質(zhì)粒，然后連接（將目的基因和表達載體連接），做原核表達，分別提取表達載體pET-28a質(zhì)粒，使用5ml菌液，濃度為50ng/ul; pMD-19T-目的基因質(zhì)粒，使用5ml菌液，濃度為150ng/ul; 我想知道的是，分別對著兩種質(zhì)粒進行雙酶切，然后膠回收目的產(chǎn)物，做連接，那么這兩種質(zhì)粒的濃度夠不夠啊？還有雙酶切體系怎么確定？ |
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酶切專家
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
weining1203: 金幣+5, ★有幫助 2012-11-09 20:25:57
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一般普通的克�。涸O(shè)計連接反應(yīng)時（10ul)，一般50-100ng回收的酶切后載體DNA就足夠了，而回收的酶切后的目的基因片段的分子數(shù)（摩爾數(shù)）為載體的分子的3-5倍�；谝陨显瓌t，一般載體酶切時需要1-2ugDNA,，考慮到回收的效率一般在50%左右，你一般可以得到0.5-1ugDNA,而回收時洗脫體積一般至少為25ul，因而你回收的載體樣品一般濃度為20-40ng/ul,這樣設(shè)計10ul的連接時，你可以考慮用2-4ul回收的載體。利用類似的方法，根據(jù)你需要回收的目的基因片段的大小以及克隆目的基因載體pMD-19T的大小，可以推算出pMD-19T酶切時的用量（取決于你目的基因的大小，目的基因越小，你需要的載體DNA越多些）。 至于雙酶切的設(shè)計，你可以利用double digestion designer進行設(shè)計，如果你知道了需要進行酶切的質(zhì)粒DNA的量和分子大小，你就可以精確計算出完全酶切所需要的酶量，使用還用很方便的，而且可以免費使用。該軟件的網(wǎng)址是http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php |
weining12032樓2012-10-23 20:36:33
weining1203
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3樓2012-10-23 21:35:50
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