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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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applexixixi

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[交流] 想擴(kuò)增10kb多的基因簇，現(xiàn)在有什么技術(shù)可以一次性擴(kuò)增出來嗎

10kb多的基因簇是連續(xù)的，想擴(kuò)增出來，在此問問蟲友們現(xiàn)在有什么技術(shù)可以解決這個(gè)問題呢？

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1樓 2012-10-24 16:40:25

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weigh1111

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你這夠嗆吧……分兩三段用高保真酶PCR出來再連接唄

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2樓2012-10-24 19:17:23

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polepolar

銀蟲 (初入文壇)

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可以試一下Phusion聚合酶,據(jù)說可以一次擴(kuò)增10k多.

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3樓2012-10-24 21:43:12

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wuyun123

禁蟲 (著名寫手)

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8樓2012-10-24 21:55:46

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zhwenxing

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1、很多長(zhǎng)片段擴(kuò)增酶類具有能力達(dá)到10kb，但模板需要相當(dāng)“平滑”
2、先用軟件分析一下看看有沒有容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域，GC比較集中的“島”
3、設(shè)計(jì)引物也非常關(guān)鍵，pcr的條件需要摸索
4、嘗試一下吧，你擴(kuò)增出來，就會(huì)有一大片粉絲啦！

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13樓2012-10-24 22:53:19

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14樓2012-10-24 23:07:47

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應(yīng)該可以的，但是擴(kuò)出來也不好測(cè)呀

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15樓2012-10-25 08:40:25

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克隆大蝦

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用過羅氏的高保真taq擴(kuò)過7-8kb的。

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16樓2012-10-25 10:28:49

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joan198108

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小丹木木: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2012-10-27 13:46:20

感覺一次擴(kuò)出來可能性有，但是這么長(zhǎng)的片段，擴(kuò)增過程出現(xiàn)突變的幾率已經(jīng)很大了，測(cè)序驗(yàn)證又比較麻煩，不驗(yàn)證肯定是不放心。這是個(gè)糾結(jié)的矛盾。

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17樓2012-10-25 10:58:42

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huiee

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推薦一篇paper 如果愿意用的話
Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting

Jun Fu,
Xiaoying Bian,
Shengbaio Hu,
Hailong Wang,
Fan Huang,
Philipp M Seibert,
Alberto Plaza,
Liqiu Xia,
Rolf Müller,
A Francis Stewart
& Youming Zhang

Affiliations
Contributions
Corresponding authors

Nature Biotechnology
30,
440–446
(2012)
doi:10.1038/nbt.2183

Received
24 October 2011
Accepted
16 March 2012
Published online
29 April 2012

Functional analysis of genome sequences requires methods for cloning DNA of interest. However, existing methods, such as library cloning and screening, are too demanding or inefficient for high-throughput application to the wealth of genomic data being delivered by massively parallel sequencing. Here we describe direct DNA cloning based on the discovery that the full-length Rac prophage protein RecE and its partner RecT mediate highly efficient linear-linear homologous recombination mechanistically distinct from conventional recombineering mediated by Redαβ from lambda phage or truncated versions of RecET. We directly cloned all ten megasynthetase gene clusters (each 10–52 kb in length) from Photorhabdus luminescens into expression vectors and expressed two of them in a heterologous host to identify the metabolites luminmycin A and luminmide A/B. We also directly cloned cDNAs and exactly defined segments from bacterial artificial chromosomes. Direct cloning with full-length RecE expands the DNA engineering toolbox and will facilitate bioprospecting for natural products.

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18樓2012-10-26 16:51:13

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blackrose8089

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Takara的primer STAR可以，DNA質(zhì)量要高些。

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19樓2012-10-26 17:48:02

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494750284

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個(gè)人覺得分別P之后連接，一下p 10kb保真性肯定不如分別P的高

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20樓2012-10-27 19:37:12

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3樓: Originally posted by polepolar at 2012-10-24 21:43:12
可以試一下Phusion聚合酶,據(jù)說可以一次擴(kuò)增10k多.

謝謝

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21樓2012-10-29 17:45:24

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applexixixi

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8樓: Originally posted by wuyun123 at 2012-10-24 21:55:46
takara寶生物的 LA Taq，可以擴(kuò)展10kb的片段。

謝謝

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22樓2012-10-29 17:45:38

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13樓: Originally posted by zhwenxing at 2012-10-24 22:53:19
1、很多長(zhǎng)片段擴(kuò)增酶類具有能力達(dá)到10kb，但模板需要相當(dāng)“平滑”
2、先用軟件分析一下看看有沒有容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域，GC比較集中的“島”
3、設(shè)計(jì)引物也非常關(guān)鍵，pcr的條件需要摸索
4、嘗試一下吧，你擴(kuò)增 ...

謝謝這么多好的建議！

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23樓2012-10-29 17:46:07

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14樓: Originally posted by aloon111 at 2012-10-24 23:07:47
分段

嗯，確實(shí)分段的可操作性強(qiáng)

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24樓2012-10-29 17:46:35

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15樓: Originally posted by jl860822 at 2012-10-25 08:40:25
應(yīng)該可以的，但是擴(kuò)出來也不好測(cè)呀

確實(shí)是個(gè)問題

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25樓2012-10-29 17:46:47

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16樓: Originally posted by 克隆大蝦 at 2012-10-25 10:28:49
用過羅氏的高保真taq擴(kuò)過7-8kb的。

哦，謝謝啦

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26樓2012-10-29 17:47:05

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17樓: Originally posted by joan198108 at 2012-10-25 10:58:42
感覺一次擴(kuò)出來可能性有，但是這么長(zhǎng)的片段，擴(kuò)增過程出現(xiàn)突變的幾率已經(jīng)很大了，測(cè)序驗(yàn)證又比較麻煩，不驗(yàn)證肯定是不放心。這是個(gè)糾結(jié)的矛盾。

嗯，你說的對(duì)，謝謝了

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27樓2012-10-29 17:47:23

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非常感謝！

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28樓2012-10-29 17:47:39

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謝謝

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29樓2012-10-29 17:47:56

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20樓: Originally posted by 494750284 at 2012-10-27 19:37:12
個(gè)人覺得分別P之后連接，一下p 10kb保真性肯定不如分別P的高

嗯，確實(shí)是，我們也是這么考慮的

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30樓2012-10-29 17:48:26

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Takara的擴(kuò)增長(zhǎng)片段的就可以，可以擴(kuò)增20多KB，而且保真性還很好。

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31樓2012-11-02 19:41:04

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

Takara的擴(kuò)增長(zhǎng)片段的就可以，可以擴(kuò)增20多KB，而且保真性還很好。

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32樓2012-11-02 19:41:44

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擴(kuò)增10kb沒什么問題，LA-Taq可以勝任，主要是模板質(zhì)量要好，引物退火溫度要達(dá)到70度左右，再用兩步法來擴(kuò)增。我13kb的都穩(wěn)定的擴(kuò)出來過。

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33樓2012-11-02 22:24:30

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