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[求助]
為什么RNA總是降解！
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要做轉(zhuǎn)錄組分析，需要制備樣品送到芯片分析公司讓他們提取RNA做轉(zhuǎn)錄組分析，但是樣品我準(zhǔn)備2次了，郵寄到他們那邊提出RNA后給出質(zhì)檢結(jié)果都是降解了，郁悶！ 我的樣品制備過程如下： （1）在設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)取樣 （2）預(yù)冷水中超聲清洗90s（我做的是吸附固定化，一般都是超聲清洗下來，整個(gè)反應(yīng)體系6ml連小瓶子都放進(jìn)去了） （3）取1ml菌液于1.5ml離心管中12000rpm離心1min,棄上清后再加入1ml離心2min。 （4）棄上清后加入1.2ml Trizol,用槍懸浮充分。 （5）液氮速凍2min. （6）立即-80保存。 （7）2天后帶干冰郵寄到公司。 （8）他們負(fù)責(zé)RNA的提取。 （9）5天后給出質(zhì)檢結(jié)果全部樣品降解（RIN在4.5-6之間；28s/18s在0.1-0.4之間） 前后兩次了發(fā)來質(zhì)檢結(jié)果都是降解，不知道到底是我的樣品準(zhǔn)備過程有問題還是其他問題？ |
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木蟲 (著名寫手)
尛森蟲
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【答案】應(yīng)助回帖
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看天: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-10-25 12:13:42
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-10-26 08:06:33
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1、細(xì)菌RNA的抽提并不困難，可以跟公司談一下，你準(zhǔn)備洗脫下來的活菌，除了超聲破碎還有其他辦法嗎？ 2、盡量用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的菌液。 3、超聲破碎細(xì)菌之后，若不立刻處理，RNA嚴(yán)重降解，這點(diǎn)我試驗(yàn)過好幾次，Rnase確實(shí)管用。 4、還是推薦送活菌由公司來處理比較合適。當(dāng)然了，公司把你的樣品如何存放的？若加入了足夠提取劑，一般4℃一周問題不大。 5、把你處理后的樣品自己小提一下，也同時(shí)提取一份活菌的，驗(yàn)證看看。 祝福好運(yùn)哈！ |
3樓2012-10-25 11:01:25
4樓2012-10-25 12:16:06
weigh1111
鐵桿木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流經(jīng)驗(yàn) 2012-10-26 08:06:47
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流經(jīng)驗(yàn) 2012-10-26 08:06:47
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樓主你也得看看公司那邊怎么處理你的菌體的~看樣子你是把菌體超聲清洗就完了，菌體是沒有破裂的~那么也就是要在公司那邊將樓主泡在trizol里面的菌體破碎再處理。假如公司沒有把菌體破裂開的話，那肯定提出來是降解的樣子…… 比如以前我提取的時(shí)候是柱子混著菌體以及trizol用機(jī)器打，抽出來常降解。后來咬咬牙用液氮磨，就再也沒問題了…… |
6樓2012-10-25 20:10:12
7樓2012-10-25 21:11:02
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