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jhonsmith001金蟲 (小有名氣)
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[求助]
詢問融合PCR反應(yīng)體系和條件
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| 哪位高手能幫我下：如果想將兩個400bp和一個5000bp的片段通過融合PCR連接起來，兩個短片段和一個長片段的加入量一般怎么算的呢？還有看有些討論說用兩步PCR反應(yīng)，即加引物和不加引物反應(yīng)，那這兩個PCR條件怎么設(shè)計呢？我的這三個片段的連接部位有20bp。非常感謝高手們能幫我解決這個頭疼問題！ |
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金蟲 (正式寫手)
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1.長片段和短片段的量都一樣； 2.PCR反應(yīng)都必須加入引物，你的意思是有些人說第一步可不加兩端的引物吧？ 3.PCR條件注意好退火溫度即可。第一步根據(jù)各片段不同用不同條件，成功P出重疊部分，不過此步一定得用Pfu酶；第二步就直接用兩端引物，根據(jù)三個片段大小以及Taq酶的合成速率來設(shè)計延伸時間。 |
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jhonsmith0012樓2013-01-07 16:38:15
jhonsmith001
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3樓2013-01-15 11:36:30
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