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[求助]
如何測(cè)定酶促反應(yīng)的初速率
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如何測(cè)定酶促反應(yīng)的初速率。 這是一道考研真題里的，他要求測(cè)定Km,Vmax和V0，前兩者我會(huì)用雙倒數(shù)作圖法就行，但V0，我想是不是就是測(cè)酶活力啊，而且書(shū)上說(shuō)，酶促反應(yīng)的初速率就是底物濃度變化在5%范圍內(nèi)時(shí)曲線的斜率，但是具體怎么控制不太清楚，希望師哥師姐幫忙解答一下 |
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wizardfan: 金幣+3, 鼓勵(lì)新蟲(chóng)發(fā)帖 2012-10-29 08:39:35
hello青果: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-10-29 12:49:26
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hello青果: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-10-29 12:49:26
| 酶促反應(yīng)的初速率是反應(yīng)剛開(kāi)始時(shí)的速率，控制酶的量一定，加入不同量的底物，有的可以用分光光度法等實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物生成量，不能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的話(huà)就在反應(yīng)一段時(shí)間后取樣用HPLC測(cè)定產(chǎn)物濃度，用HPLC監(jiān)測(cè)最主要的是確定多長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)取樣才能代表初速度，有的是幾分鐘，有的是幾小時(shí)，這個(gè)要根據(jù)產(chǎn)物生成的量來(lái)判斷，然后用單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量代表反應(yīng)初速率 |
2樓2012-10-29 08:20:56
3樓2012-10-29 12:52:59
【答案】應(yīng)助回帖
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hello青果: 金幣+8, ★★★★★最佳答案 2012-10-30 12:42:43
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你要測(cè)Km,Vmax就要測(cè)定一定的酶濃度下不同底物時(shí)的初速度，底物濃度的變化范圍可以從1/10km到10km,在這個(gè)范圍內(nèi)取幾個(gè)點(diǎn)比如c1,c2,c3,c4，分別測(cè)定這幾個(gè)底物濃度下的初速度v1,v2,v3,v4，根據(jù)米氏方程v=Vmax ×S/（Km+S）就能得到Km,Vmax，很簡(jiǎn)單的。難的是剛開(kāi)始的時(shí)候你并不知道多少底物能使這一定量的酶飽和，因此你要做個(gè)試驗(yàn)，配幾個(gè)底物梯度，比如1m/l 2m/l 3m/l 4m/l，比如它們的初速度分別為 0.1m/l.min，0.3m/l.min，0.5m/l.min，0.5m/l.min，我們可以看出后面兩個(gè)底物濃度下的初速度是一樣的，即酶在這兩個(gè)底物濃度下已經(jīng)飽和，我們就是通過(guò)這種方式來(lái)找出飽和底物濃度的，在飽和底物濃度下的初速度就是Vmax。還有一個(gè)問(wèn)題也很關(guān)鍵，就是如何知道你測(cè)的速度是初速度，如果能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的話(huà)那就很容易了，你可以得到一個(gè)產(chǎn)物濃度隨時(shí)間變化的曲線，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)需要你知道產(chǎn)物在多少波長(zhǎng)下有吸收峰，并且吸收值與濃度有線性關(guān)系；如果不能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，我們是用HPLC來(lái)測(cè)產(chǎn)物濃度，隔一段時(shí)間取一次樣，還要弄清楚你的酶促反應(yīng)是什么時(shí)間尺度來(lái)計(jì)量，是秒，分鐘還是小時(shí)，這都需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，像我們用的酶要用小時(shí)做時(shí)間尺度，我們是在反應(yīng)2h后取樣用H[LC測(cè)產(chǎn)物濃度來(lái)計(jì)算反應(yīng)的初速度。 你說(shuō)的“在底物濃度變化5%范圍內(nèi)求斜率”，這得出的是某一底物濃度下的初速度，底物和產(chǎn)物的濃度都要測(cè)，只做這一個(gè)曲線是得不到Km,Vmax的 |
4樓2012-10-29 19:25:26
5樓2012-10-30 12:43:36
923158905
銅蟲(chóng) (小有名氣)
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您好，測(cè)定初速度時(shí)教科書(shū)上要求底物消耗在5%以?xún)?nèi)，如果按照此要求進(jìn)行測(cè)定，誤差會(huì)不會(huì)很大? 有文獻(xiàn)里測(cè)定不同酶濃度和不同反應(yīng)時(shí)間的反應(yīng)速率以找出合適的酶濃度和反應(yīng)時(shí)間，這樣做的具體作用是什么？如果滿(mǎn)足底物5%消耗是否就不用找出合適的酶濃度和反應(yīng)時(shí)間？只有當(dāng)?shù)孜锍^(guò)5%才考慮酶濃度和反應(yīng)時(shí)間在線性范圍內(nèi)，請(qǐng)問(wèn)是這樣嗎？ |
6樓2016-01-13 22:00:51
檸檬Anny
新蟲(chóng) (初入文壇)
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- 注冊(cè): 2018-04-15
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您好，想請(qǐng)教關(guān)于酶促反應(yīng)速率，Vmax，Km，的問(wèn)題，您之前的解答我已經(jīng)看過(guò)了，也做了實(shí)驗(yàn)，可實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)波動(dòng)性太大，不知如何選擇 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
7樓2018-04-15 14:11:33
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