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如何測定酶促反應的初速率
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如何測定酶促反應的初速率。 這是一道考研真題里的，他要求測定Km,Vmax和V0，前兩者我會用雙倒數(shù)作圖法就行，但V0，我想是不是就是測酶活力啊，而且書上說，酶促反應的初速率就是底物濃度變化在5%范圍內(nèi)時曲線的斜率，但是具體怎么控制不太清楚，希望師哥師姐幫忙解答一下 |
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【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
hello青果: 金幣+8, ★★★★★最佳答案 2012-10-30 12:42:43
hello青果: 金幣+8, ★★★★★最佳答案 2012-10-30 12:42:43
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你要測Km,Vmax就要測定一定的酶濃度下不同底物時的初速度，底物濃度的變化范圍可以從1/10km到10km,在這個范圍內(nèi)取幾個點比如c1,c2,c3,c4，分別測定這幾個底物濃度下的初速度v1,v2,v3,v4，根據(jù)米氏方程v=Vmax ×S/（Km+S）就能得到Km,Vmax，很簡單的。難的是剛開始的時候你并不知道多少底物能使這一定量的酶飽和，因此你要做個試驗，配幾個底物梯度，比如1m/l 2m/l 3m/l 4m/l，比如它們的初速度分別為 0.1m/l.min，0.3m/l.min，0.5m/l.min，0.5m/l.min，我們可以看出后面兩個底物濃度下的初速度是一樣的，即酶在這兩個底物濃度下已經(jīng)飽和，我們就是通過這種方式來找出飽和底物濃度的，在飽和底物濃度下的初速度就是Vmax。還有一個問題也很關(guān)鍵，就是如何知道你測的速度是初速度，如果能實時監(jiān)測的話那就很容易了，你可以得到一個產(chǎn)物濃度隨時間變化的曲線，實時監(jiān)測需要你知道產(chǎn)物在多少波長下有吸收峰，并且吸收值與濃度有線性關(guān)系；如果不能實時監(jiān)測，我們是用HPLC來測產(chǎn)物濃度，隔一段時間取一次樣，還要弄清楚你的酶促反應是什么時間尺度來計量，是秒，分鐘還是小時，這都需要通過實驗來確定，像我們用的酶要用小時做時間尺度，我們是在反應2h后取樣用H[LC測產(chǎn)物濃度來計算反應的初速度。 你說的“在底物濃度變化5%范圍內(nèi)求斜率”，這得出的是某一底物濃度下的初速度，底物和產(chǎn)物的濃度都要測，只做這一個曲線是得不到Km,Vmax的 |
4樓2012-10-29 19:25:26
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
wizardfan: 金幣+3, 鼓勵新蟲發(fā)帖 2012-10-29 08:39:35
hello青果: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-10-29 12:49:26
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hello青果: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-10-29 12:49:26
| 酶促反應的初速率是反應剛開始時的速率，控制酶的量一定，加入不同量的底物，有的可以用分光光度法等實時監(jiān)測產(chǎn)物生成量，不能實時監(jiān)測的話就在反應一段時間后取樣用HPLC測定產(chǎn)物濃度，用HPLC監(jiān)測最主要的是確定多長時間內(nèi)取樣才能代表初速度，有的是幾分鐘，有的是幾小時，這個要根據(jù)產(chǎn)物生成的量來判斷，然后用單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量代表反應初速率 |
2樓2012-10-29 08:20:56
3樓2012-10-29 12:52:59
5樓2012-10-30 12:43:36
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