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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » RT-PCR求助
| 查看: 1672 | 回復: 12 | |||
淘氣維尼89木蟲 (小有名氣)
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[求助]
RT-PCR求助
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最近在做RT-PCR，使用的材料是實驗室自己誘導培養(yǎng)的植物愈傷組織，提取RNA之后，逆轉錄合成cDNA，以此為模板進行PCR。擴增過500bp左右的基因，以及1500bp左右的基因，都沒有擴出來條帶。將cDNA稀釋10倍后，500bp的基因片段擴出來了，但是空白對照也有條帶。并且?guī)Э撞桓蓛�，感覺有東西沒跑出來似的。請大家?guī)蛶兔Ψ治鲆幌聠栴}出在哪，別的老師說問題可能有兩個方面：一是RNA質(zhì)量不好。二是選擇的細胞不好，有退化，所以大片段就擴不出來 這是1500bp的基因，沒有目的條帶 這是500bp的基因，有目的條帶，最右邊是空白對照 |
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2樓2012-10-30 19:10:59
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7樓2012-10-31 08:24:42
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【答案】應助回帖
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個人建議，僅供參考！ 1.不是十分同意樓上所說的污染說法，如果僅僅是污染條帶不會這么清晰； 2.建議你查一下你要的mRNA占總mRNA的比例，然后調(diào)整PCR時加cDNA的量； 3.500bp的雖然出現(xiàn)了條帶，但個人感覺不是你想要的東西，可以膠回收你要的那條帶，然后用膠回收產(chǎn)物做模板二次PCR或者克隆測序檢驗一下； 4.選用適合擴增長片段的逆轉錄酶，或者在RT的時候更換隨機引物或者特異性引物進行RT，且要注意RT溫度的變化； 5.點樣孔那里出現(xiàn)的白色條帶可能是PCR體系里的聚合酶等蛋白或buffer里面的一些鹽造成的。 |
9樓2012-10-31 09:41:15
xiaoyi-1988
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10樓2012-10-31 10:03:51
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