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[求助]
你們都測哪些指標(biāo)
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| 做有關(guān)植物的毒理實(shí)驗(yàn)，大家一般都測哪些指標(biāo)呢?感覺自己測的指標(biāo)好少，我測抗氧化酶系（SOD/POD/CAT），MDA，還想測個(gè)超氧陰離子（O2-），大家覺著有沒有必要呢，是不是和前面哪個(gè)指標(biāo)重復(fù)？另外大家給我推薦幾個(gè)植物常測的方法比較成熟的指標(biāo)啊. |
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starseacow
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyfgood: 金幣+20, 為專家的博學(xué)與熱心鼓掌！ 2012-11-08 23:29:33
gyfgood: 金幣+20, 為專家的博學(xué)與熱心鼓掌！ 2012-11-08 23:29:33
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上一個(gè)帖子可能講得太籠統(tǒng)。估計(jì)樓主是想研究某種物質(zhì)處理植物造成的一系列和ROS迸發(fā)相關(guān)的反應(yīng)。關(guān)于ROS工作，前一段時(shí)間我分享過一篇文章，你可以看看 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=4835328 關(guān)于測哪些指標(biāo)，重點(diǎn)在于你要解決什么問題，指標(biāo)測的再多，說明不了任何問題，那就是浪費(fèi)時(shí)間精力�，F(xiàn)在可以說幾乎所有外界刺激與損傷，都會(huì)引起ROS迸發(fā)，抗氧化酶系活性變化，那么你單純測這些東西說實(shí)話沒意義，就算發(fā)文章也頂多是灌水的水平。舉個(gè)好文章的例子： Arabidopsis Nitric Oxide Synthase 1 Is Targeted to Mitochondria and Protects against Oxidative Damage and Dark-Induced Senescence Fang-Qing Guo and Nigel M. Crawford The Plant Cell December 2005 vol. 17 no. 12 3436-3450 這篇文章研究了線粒體NOS1對刺激的反應(yīng)，以及NOS1帶來的NO與ROS迸發(fā)的關(guān)系，并沒有羅列一大堆各種各樣抗氧化指標(biāo)，而是為了證明自己的觀點(diǎn)，認(rèn)真的選取公認(rèn)可信的方法，做出漂亮可信的結(jié)果。這樣的工作解決問題，完整的講了一個(gè)故事，所以可以發(fā)到頂級雜志。咱們現(xiàn)在做的工作離plant cell可能很遙遠(yuǎn)，但至少可以從想法和研究思路上向他們看齊。 我看過也解答過很多樓主的帖子，感覺你嘗嘗糾結(jié)于一些很細(xì)節(jié)的實(shí)驗(yàn)問題，這很可能是由于你所在實(shí)驗(yàn)組沒有支持你的條件，可以理解，深表同情，我也愿意盡可能幫你解決這些問題。但我感覺更重要的是你需要對自己的課題有更深入和全面的思考，在研究到底怎么做某些實(shí)驗(yàn)之前，更重要的是明白你的課題涉及哪些內(nèi)容，目前的最新研究進(jìn)展是什么，有哪些問題還沒有答案，自己如果要回答這些問題要怎么做等等。 |
3樓2012-11-05 18:41:06
starseacow
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2樓2012-11-05 17:02:35
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感謝你一直以來對我的幫助，我也發(fā)現(xiàn)了只要我發(fā)帖子一般都是等你來回答  ，感覺你挺厲害的。我的實(shí)驗(yàn)做的也挺糾結(jié)的，各種不會(huì)各種不明白，大學(xué)知識(shí)全白學(xué)了現(xiàn)在一點(diǎn)用不上，等于從頭再來，老師給我定的課題又是我們實(shí)驗(yàn)室的先例，我是帶頭做的對我期望很大，師哥師姐不做這方面也沒法幫我，更是難上加難，目前書上有的常規(guī)指標(biāo)測的馬馬虎虎還算過關(guān)，老板就老是糾結(jié)于ROS和彗星實(shí)驗(yàn)上，因?yàn)樗X著這是我們實(shí)驗(yàn)室的特色。彗星太難了，小麥，單子葉植物，想取細(xì)胞核來做彗星，我就看過兩篇文獻(xiàn)，但一篇是培養(yǎng)的愈傷組織，還有一篇是直接養(yǎng)的小麥做的，而且作者是我以前的師哥，我現(xiàn)在天天聯(lián)系他問，最后他都怕了，把博士論文發(fā)給我說：我真不記得當(dāng)時(shí)怎么做的了你自己好好看看我的論文吧，而且一直勸我換指示生物，但是這是我們老師的國家自然基金的課題定的沒法換。ROS我也了解了一些，最常用的就是DCFH-DA，而且我們實(shí)驗(yàn)室做動(dòng)物的也是用這個(gè)方法，儀器軟件啥的都準(zhǔn)備好了，那個(gè)什么激光共聚焦顯微鏡我都沒見過。。。，所以我研究了下他們動(dòng)物的方法原理，感覺就是取線粒體再加探針最好能測熒光強(qiáng)度。我按這方法來試驗(yàn)了下，取植物線粒體再加探針測，試驗(yàn)階段很成功，我以為行了，但是正式實(shí)驗(yàn)就出問題了，有的處理組沒數(shù)據(jù)或很小，最近又試了好多次都不行，就是想不明白哪有問題，覺著是葉綠體影響了熒光強(qiáng)度，或者我沒取到線粒體，但是以前就是這么做的。。我又用根嘗試做，又有數(shù)據(jù)了，但是我前面指標(biāo)全是用葉測的，這個(gè)用根測老板說不行�，F(xiàn)在我就一直糾結(jié)于這兩個(gè)指標(biāo)，所以就想到了用其他指標(biāo)代替。你推薦給我的這篇文章我看過，我覺著測O2-和測SOD是重復(fù)的，測H2O2和測CAT時(shí)重復(fù)的，所以想測個(gè)總的ROS，這種想法對不對? 另外我剛看了一篇文獻(xiàn)測擬南芥ROS就是加探針測熒光強(qiáng)度，不知道你看過沒？The alternative oxidase lowers mitochondrial reactive oxygen production in plant cells. DENIS P. MAXWELL*, YONG WANG*, AND LEE MCINTOSH但是文獻(xiàn)太籠統(tǒng)了，我老是從文獻(xiàn)中學(xué)不到啥。 還有一點(diǎn)不明白的是，我看用DCFH-DA測ROS老提到什么六孔板什么的，感覺雖然都是用DCFH-DA法測的具體步驟也是不一樣的。我們都是直接提取線粒體，計(jì)算蛋白，根據(jù)蛋白量確定加的線粒體酶液量，最后再以每毫克蛋白的熒光強(qiáng)度表示結(jié)果來表明ROS的量。你要是感興趣的話我可以告訴你這個(gè)方法的具體，順便也幫我研究下這個(gè)方法，看我的思路是否可靠？我們師哥用這方法剛發(fā)了一篇文章，關(guān)于斑馬魚的，在Aquatic Toxicology上，題目是Effects of the ionic liquid [Omim]PF6 on antioxidant enzyme systems, ROS and DNA damage in zebrafish (Danio rerio)你有興趣可以看下。 |
4樓2012-11-05 19:50:02
starseacow
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
a71840584: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-11-09 23:14:40
a71840584: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-11-09 23:14:40
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動(dòng)物的方法是否可以直接用在植物上，很難說。你的問題，很顯然是葉綠體影響，這也就是為什么根做出來而葉子不行。關(guān)于活性氧迸發(fā)，測定各種活性氧和測定抗氧化酶是兩個(gè)概念，不能互相替代。不同活性氧存在一定的相互轉(zhuǎn)化，因?yàn)樗麄兲幱谝粋�(gè)代謝系統(tǒng)內(nèi)，同時(shí)，不同活性氧也有不同的信號作用，譬如我以前做過的工作顯示某種次生代謝產(chǎn)物只受到H2O2調(diào)控，超氧和羥自由基并不影響。（當(dāng)然，是否都要測定取決于你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模乙郧案愦紊x做活性氧，幾個(gè)指標(biāo)都測過，現(xiàn)在的組做活性氧，就考慮一個(gè)H2O2，照樣出好文章。） 關(guān)于實(shí)驗(yàn)方法，我還是建議你使用別的做植物的文獻(xiàn)上有報(bào)道的，且大家都用的方法。PNAS的方法講得還算詳細(xì)啊，有什么看不懂的？ |
5樓2012-11-05 21:15:50
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嗯，他這一段Detection of Reactive Oxygen Species. Spectrofluorometry. Intracellular production of ROS was measured by using 29,79- dichlorof luorescein diacetate (H2DCF-DA; Molecular Probes). This nonpolar compound is converted to the membrane- impermeant polar derivative H2DCF by esterases when it is taken up by the cell. H2DCF is nonfluorescent but is rapidly oxidized to the highly fluorescent DCF by intracellular H2O2 and other peroxides (20). Stocks of H2DCF-DA (5 mM) were made in ethanol and stored in the dark at 280°C under argon. H2DCF-DA was added to cells at a final concentration of 5 mM. After a 30-min incubation, cells were collected in a microcentrifuge, and the supernatant was removed and diluted 50-fold. Fluorescence was measured by using a Hitachi F2000 fluorescence spectrophotometer (Tokyo) with excitation and emission wavelengths set at 488 nm and 520 nm, respectively 這段講的就是用熒光分光光度計(jì)去測熒光強(qiáng)度來表示ROS，我的方法和他基本一致，就是加的探針濃度不同（我是10mmol的探針稀釋50倍）我不明白的是他說把探針加入細(xì)胞？哪來的細(xì)胞？直接從植物上分離得到的？取整個(gè)細(xì)胞不取線粒體？他的細(xì)胞不受葉綠體影響嗎？還有他最后的結(jié)果表示的我也沒看懂，他列的熒光強(qiáng)度是加了多少細(xì)胞后的？怎么這么表示嗎？我們ROS表示都是像SOD和CAT一樣是以每毫克蛋白所含的量來衡量的。 |
6樓2012-11-06 23:02:50
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【答案】應(yīng)助回帖
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文章關(guān)于方法第一節(jié)就寫著 Plant Material and Growth Conditions. Cultured tobacco cells (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) containing Aox1 in either sense (S11) or antisense (AS8) orientation have been characterized (9, 10). All experiments were conducted with exponentially growing cells 3–4 days after subculture 結(jié)果部分，測定ROS的圖 Figure 1 Intracellular ROS abundance in WT and Aox1 transgenic cultured tobacco cells. |
7樓2012-11-07 00:25:13
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8樓2012-11-07 00:28:00
9樓2012-11-07 21:51:44
10樓2012-11-07 21:57:10
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