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小靈仙兒新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
求助，關(guān)于pcr擴(kuò)增后產(chǎn)物序列在ncbi上的比對(duì)，以及3' race接頭引物的設(shè)計(jì)。。
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我是研一的，剛接觸實(shí)驗(yàn)，什么都不懂，在摸索過(guò)程中，希望大家多多幫助。。 兩個(gè)問(wèn)題，第一，我通過(guò)pcr擴(kuò)增出了一個(gè)與預(yù)期大小一樣的片段，pcr產(chǎn)物沒(méi)有經(jīng)過(guò)純化回收就直接送到公司測(cè)序了。然后把測(cè)序結(jié)果在ncbi上比對(duì)了一下，結(jié)果我看不懂，希望大家?guī)臀曳治鲆幌隆?br /> 我測(cè)得的這個(gè)序列是我想要的基因么？為什么會(huì)中間空掉那么多？能接著往下做3' race么？ 下面這個(gè)是我pcr的電泳圖 第二個(gè)問(wèn)題，接著往下做3' race，不買(mǎi)試劑盒，自己合成接頭引物該怎么設(shè)計(jì)。。我從網(wǎng)上找了引物試了一下，結(jié)果就是，都沒(méi)有結(jié)果。。  這是我的接頭引物（從網(wǎng)上借的），3'ap-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3'Primer-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG 這個(gè)是自己設(shè)計(jì)的特異性引物，不過(guò)是根據(jù)上面那個(gè)公司測(cè)序序列設(shè)計(jì)的，很可能有很大關(guān)系，GSP1-TCGAACAACCGTTTATCAGGGCCAGTC 調(diào)了退火溫度，換了rna模板的結(jié)果都是這樣。我個(gè)人覺(jué)得是引物問(wèn)題，是接頭引物不能通用？還是需要我重新測(cè)中間片段的序列再設(shè)計(jì)特異性引物？ 因?yàn)槭切氯�，�?wèn)題比較多，但是金幣比較少，希望大家不吝賜教，先謝謝各位了，幫助我進(jìn)步吧。。  |
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