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求關于Overlap PCR(重疊延伸PCR)的具體實驗過程及原理
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求關于Overlap PCR(重疊延伸PCR)的具體實驗過程及原理，最好是文獻或者書籍章節(jié)，中英文都可以~ [ 來自科研家族 外貌協(xié)會 ] |
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1949stone: 金幣+5, MolEPI+1, very good 2012-12-03 16:55:36
我是傳奇456: 金幣+5, ★★★★★最佳答案, 很好，很詳細。 2012-12-03 20:33:29
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重疊延伸PCR，我覺得可以分兩種： 第一種：用重疊延伸PCR做定點突變，采用重疊引物延伸PCR介導做定點突變實際上是一種快速高效的在基因中特定位點引入特定突變的有效技術。其基本原理就是采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了一小段的重疊鏈, 然后在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。 該技術主要包括以下幾步： (1) 設計引物，PCR擴增基因兩端 (2) 回收兩端片段 (3) 兩端片段退火延伸，擴增全長基因 1. 引物設計 重疊延伸PCR做定點突變引物的設計，如下圖所示。 引物F及R為基因兩端特異引物，其中Fm及Rm為中間引物。其中引物Fm及Rm中間共享一段序列（至少10bp完全匹配），*為突變點，突變點最好是位于引物的5’端，盡量避免出現(xiàn)在3’端。然后分別用引物F和Rm及Fm和R進行配對進行PCR。該步一定要用pfu酶，不能用Taq酶，因為Taq酶容易在PCR產(chǎn)物末端加A，會造成產(chǎn)物移碼突變。 2. 分別回收第1步所得兩條PCR產(chǎn)物 3. 將第2步所得兩份PCR產(chǎn)物進行混合使其互為模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶及引物F和R進行PCR擴增出具有突變的全基因。 第二種：用重疊延伸PCR做序列缺失突變，即重疊延伸PCR技術(gene splicing by overlap extension PCR,簡稱SOE PCR) 以下是重疊延伸PCR的原理及兩基因的引物設計： （1）引物設計：引物a和d是常規(guī)引物；b的左半段為常規(guī)引物，右半段為基因Ⅱ的引物序列；c同理；則b和c的部分堿基可互補配對。 （2）基因I、Ⅱ分別擴增，產(chǎn)物相應為片段ab和cd。 （3）兩種產(chǎn)物混合，經(jīng)變性及退火處理，a鏈和d鏈部分堿基互補配對，成雜交鏈。在DNA polymerase作用下，a和d鏈互為引物和模板，合成出長'鏈，即為基因I和基因Ⅱ的接接產(chǎn)物。 2012-12-03_160715.jpg |
2樓2012-12-03 16:45:55
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3樓2012-12-03 19:36:36
Yummyoo
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