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求關(guān)于Overlap PCR(重疊延伸PCR)的具體實(shí)驗(yàn)過程及原理
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求關(guān)于Overlap PCR(重疊延伸PCR)的具體實(shí)驗(yàn)過程及原理，最好是文獻(xiàn)或者書籍章節(jié)，中英文都可以~ [ 來自科研家族 外貌協(xié)會 ] |
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gyesang
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我是傳奇456: 金幣+5, ★★★★★最佳答案, 很好，很詳細(xì)。 2012-12-03 20:33:29
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重疊延伸PCR，我覺得可以分兩種： 第一種：用重疊延伸PCR做定點(diǎn)突變，采用重疊引物延伸PCR介導(dǎo)做定點(diǎn)突變實(shí)際上是一種快速高效的在基因中特定位點(diǎn)引入特定突變的有效技術(shù)。其基本原理就是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了一小段的重疊鏈, 然后在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來。 該技術(shù)主要包括以下幾步： (1) 設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增基因兩端 (2) 回收兩端片段 (3) 兩端片段退火延伸，擴(kuò)增全長基因 1. 引物設(shè)計(jì) 重疊延伸PCR做定點(diǎn)突變引物的設(shè)計(jì)，如下圖所示。 引物F及R為基因兩端特異引物，其中Fm及Rm為中間引物。其中引物Fm及Rm中間共享一段序列（至少10bp完全匹配），*為突變點(diǎn)，突變點(diǎn)最好是位于引物的5’端，盡量避免出現(xiàn)在3’端。然后分別用引物F和Rm及Fm和R進(jìn)行配對進(jìn)行PCR。該步一定要用pfu酶，不能用Taq酶，因?yàn)門aq酶容易在PCR產(chǎn)物末端加A，會造成產(chǎn)物移碼突變。 2. 分別回收第1步所得兩條PCR產(chǎn)物 3. 將第2步所得兩份PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合使其互為模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶及引物F和R進(jìn)行PCR擴(kuò)增出具有突變的全基因。 第二種：用重疊延伸PCR做序列缺失突變，即重疊延伸PCR技術(shù)(gene splicing by overlap extension PCR,簡稱SOE PCR) 以下是重疊延伸PCR的原理及兩基因的引物設(shè)計(jì)： （1）引物設(shè)計(jì)：引物a和d是常規(guī)引物；b的左半段為常規(guī)引物，右半段為基因Ⅱ的引物序列；c同理；則b和c的部分堿基可互補(bǔ)配對。 （2）基因I、Ⅱ分別擴(kuò)增，產(chǎn)物相應(yīng)為片段ab和cd。 （3）兩種產(chǎn)物混合，經(jīng)變性及退火處理，a鏈和d鏈部分堿基互補(bǔ)配對，成雜交鏈。在DNA polymerase作用下，a和d鏈互為引物和模板，合成出長'鏈，即為基因I和基因Ⅱ的接接產(chǎn)物。 2012-12-03_160715.jpg |
2樓2012-12-03 16:45:55
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3樓2012-12-03 19:36:36
Yummyoo
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