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[求助]
油菜DNA提取問題，用的CTAB法提取，要求質(zhì)量高點(diǎn)
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| 如題，dna用來做snp，是用液氮磨樣還是用打樣機(jī)打樣提的質(zhì)量好，有經(jīng)驗(yàn)的告訴一下 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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帝封天下: 金幣+20, ★有幫助 2012-12-12 21:13:08
amisking: 回帖置頂 2012-12-12 22:48:30
amisking: 金幣+5, APEPI+1, 鼓勵(lì)積極發(fā)帖幫助解答問題。 2012-12-12 22:48:39
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基因組DNA提取 試劑與溶液 (1)2%CTAB抽提緩沖溶液：CTAB4g，NaCl16.364g，先用70mLddH2O溶解，再加入1mol/L Tris-HCl(pH8.0)20mL、0.5mol/LEDTA(pH8.0)8mL，定容至200mL。滅菌，冷卻后加入0.2%-1%琉基乙醇400μL。 (2)氯仿︰異戊醇=24︰1(V/V)：先加96mL氯仿，再加4mL異戊醇，搖勻。 (3)0.5mol/LEDTA(pH8.0)：186.21gNa2EDTA•2H2O溶于750mLddH2O，加入2mol/LNaOH至pH8.0，用ddH2O定容至1000mL。 (4)1mol/L Tris-HCl(pH8.0)：121g Tris堿溶于750mLddH2O，加濃HCl至pH8.0，ddH2O定容至1000mL。 (5)TE緩沖液：1mol/LTris-HCl(pH8.0)5mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)1mL，ddH2O定容至500mL。 (6)10mg/mL RNase A(-20℃保存)：1mol/LTris-HCl(pH8.0)10μL，0.5mol/LNaCl30μL，RNase A10mg，ddH2O定容至1mL。 (7)75%乙醇：取無水乙醇375mL，加ddH2O至500mL。 (8)異丙醇 (7)、(8)使用前冷藏1-2小時(shí)。 方法與步驟 (1)將油菜自交系的種子在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)，待長(zhǎng)至一定高度時(shí)，取幼嫩葉片作為提取DNA的材料。 (2)將2%CTAB提取液放入65℃水浴中預(yù)熱5分鐘。 (3)稱取0.3-0.5g幼嫩葉片，放入研缽，加液氮后迅速研磨成粉末狀。 (4)將葉片粉末迅速、小心地刮入2mL離心管中，加入1.0mL 65℃預(yù)熱的2%CTAB提取液，顛倒混勻。 (5)將離心管放入65℃水浴中，保溫40分鐘，其間輕搖幾次。 (6)取出離心管，在室溫下放置1-2分鐘，加入氯仿︰異戊醇(24︰1)至滿管，上下顛倒搖晃2-3min，待兩者混合均勻，以12000r/min的速度離心6min。 (7)移液器吸取上清至1.5mL滅菌離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒搖勻約30s，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物。 (8)以12000r/min離心5min，倒掉液體，注意勿將白色DNA沉淀倒出，將離心管倒立與鋪開的紙巾上。 (9)60s后，直立離心管，用75%的乙醇洗2-3次，置于超凈工作臺(tái)風(fēng)干(1-2h即可，若過分干燥，DNA沉淀會(huì)較難溶解)。 (10)加入50μL含RNase A(濃度10µg/mL)的TE緩沖液，37℃保溫1-2小時(shí)，-20℃冷藏備用；在0.8%瓊脂糖凝膠電泳上檢查DNA完整性。 (11)利用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度及純度，并稀釋至60ng/µL備用。 |
3樓2012-12-12 20:41:44
xy656691
金蟲 (正式寫手)
- APEPI: 1
- 應(yīng)助: 37 (小學(xué)生)
- 貴賓: 0.248
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- 注冊(cè): 2012-03-11
- 性別: GG
- 專業(yè): 免疫學(xué)研究新技術(shù)與新方法
2樓2012-12-11 14:49:55
lanqingkuo
木蟲 (小有名氣)
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- 蟲號(hào): 1338757
- 注冊(cè): 2011-07-06
- 性別: GG
- 專業(yè): 植物生理與生化
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預(yù)處理樣品中加入800 µL裂解緩沖液、10 µL蛋白酶K（20 mg/ml）和5 µL RNA酶（10 mg/ml），振蕩混勻，于65℃水浴60-90 min；16000 g離心10 min； 取上清，加500 µL氯仿異戊醇，顛倒混勻30 s；16000 g離心10 min；取上清，加500 µL氯仿異戊醇，顛倒混勻30 s；16000 g離心5 min； 取上清，加2倍體積的沉淀緩沖液，顛倒混勻，室溫放置60 min；16000 g離心10 min；棄上清，加350 µLNaCl溶液回溶；加500 µL氯仿異戊醇，顛倒混勻30 s；16000 g離心10 min； 取上清，加0.6倍體積的預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，于-20 ℃放置30 min；16000 g離心10 min；棄上清，加500 µL 70%乙醇溶液，顛倒混勻清洗沉淀；16000 g離心10 min；棄上清，室溫下風(fēng)干后使用40 µL水回溶沉淀。 |
4樓2012-12-13 20:15:47
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