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hwchen2000金蟲 (正式寫手)
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[求助]
RT-PCR高手請進(jìn)
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我現(xiàn)在做RT-PCR多次，只有一次做第二鏈合成電泳后顯示有約1000bp的條帶，但是再也沒有重復(fù)出來，所以想請教一下各位高手 RNA模板約1ug 我的PCR引物是 forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3' rewards: 5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3' （小寫為保護(hù)堿基） 請大俠幫我驗(yàn)證這個引物的退火溫度，我現(xiàn)在是55℃ 求教了��！ |
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 PCR技術(shù) | 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 |
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zhaodahe
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4樓2012-12-18 12:56:11
zhaodahe
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2樓2012-12-18 12:27:32
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RT-PCR即反轉(zhuǎn)錄PCR，需要注意的有以下幾點(diǎn)： 1、首先看RNA是否完整，一般RNA電泳檢測，28S的亮度約是18S的兩倍，說明RNA完整，否則會含有其他RNA，比如mRNA，會影響后續(xù)逆轉(zhuǎn)； 2、我們做逆轉(zhuǎn)一般用的是Takara的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，逆轉(zhuǎn)效果還不錯吧。先看你逆轉(zhuǎn)時RNA加的量是否合適，過小或過高都影響逆轉(zhuǎn)效果，再看你逆轉(zhuǎn)的過程是不是有差錯； 3、逆轉(zhuǎn)為cDNA后，先用其他常用基因檢測下cDNA的質(zhì)量，比如先擴(kuò)增actin，一般這個退火溫度是確定的，如果結(jié)果好再擴(kuò)增你的目的基因，至少說明模板沒問題； 4、能擴(kuò)出actin基因而擴(kuò)不出你的目的基因，可以做退火溫度梯度，一般我們用這個引物設(shè)計軟件http://www.sigma-genosys.com/calc/DNAcalc.asp 測出的退火溫度-5度都能PCR出結(jié)果，除非上下游引物退火溫度差距太大 希望對你能有幫助！ |
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hwchen20005樓2012-12-18 17:26:04
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