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hwchen2000金蟲 (正式寫手)
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[求助]
RT-PCR高手請(qǐng)進(jìn)
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我現(xiàn)在做RT-PCR多次，只有一次做第二鏈合成電泳后顯示有約1000bp的條帶，但是再也沒(méi)有重復(fù)出來(lái)，所以想請(qǐng)教一下各位高手 RNA模板約1ug 我的PCR引物是 forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3' rewards: 5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3' （小寫為保護(hù)堿基） 請(qǐng)大俠幫我驗(yàn)證這個(gè)引物的退火溫度，我現(xiàn)在是55℃ 求教了��！ |
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RT-PCR即反轉(zhuǎn)錄PCR，需要注意的有以下幾點(diǎn)： 1、首先看RNA是否完整，一般RNA電泳檢測(cè)，28S的亮度約是18S的兩倍，說(shuō)明RNA完整，否則會(huì)含有其他RNA，比如mRNA，會(huì)影響后續(xù)逆轉(zhuǎn)； 2、我們做逆轉(zhuǎn)一般用的是Takara的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，逆轉(zhuǎn)效果還不錯(cuò)吧。先看你逆轉(zhuǎn)時(shí)RNA加的量是否合適，過(guò)小或過(guò)高都影響逆轉(zhuǎn)效果，再看你逆轉(zhuǎn)的過(guò)程是不是有差錯(cuò)； 3、逆轉(zhuǎn)為cDNA后，先用其他常用基因檢測(cè)下cDNA的質(zhì)量，比如先擴(kuò)增actin，一般這個(gè)退火溫度是確定的，如果結(jié)果好再擴(kuò)增你的目的基因，至少說(shuō)明模板沒(méi)問(wèn)題； 4、能擴(kuò)出actin基因而擴(kuò)不出你的目的基因，可以做退火溫度梯度，一般我們用這個(gè)引物設(shè)計(jì)軟件http://www.sigma-genosys.com/calc/DNAcalc.asp 測(cè)出的退火溫度-5度都能PCR出結(jié)果，除非上下游引物退火溫度差距太大 希望對(duì)你能有幫助！ |
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hwchen20005樓2012-12-18 17:26:04
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3樓2012-12-18 12:32:59
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6樓2012-12-21 13:38:56
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我曾經(jīng)遇到過(guò)與你相同的問(wèn)題，只是你的目的片段比較大，我覺(jué)得最好從以下幾個(gè)方面考慮： 1.首先一定要保證你的RAN的純度和完整性都要好，主要是純度一定要好！這一步是基礎(chǔ)。 2.在做RT的時(shí)候，可以嘗試增大RNA的量，2ug也可以，不過(guò)一定要在冰上進(jìn)行。 3.做PCR這一步的時(shí)候，我覺(jué)得你最好使用快速高保真酶來(lái)擴(kuò)增，可以用PrimeStar這種酶來(lái)擴(kuò)增，可以先擴(kuò)增內(nèi)參看看。這一步我覺(jué)得退火溫度可能不會(huì)是大的問(wèn)題，主要是酶，體系最好是25ul，不要用50ul的體系。 4.如果一直沒(méi)有結(jié)果的話，沒(méi)有辦法，只有從頭再做，保證每一步都是可信的，然后再往下做。 |
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7樓2012-12-21 20:34:51
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hwchen2000: 金幣+5 2013-01-02 11:10:17
| 1000bp根本不算大！第一用內(nèi)參基因擴(kuò)一下 ，確認(rèn)模版能用，也確認(rèn)你的PCR所有試劑能用。第二退火溫度用三倍GC+2倍的AT算一下，我感覺(jué)退火溫度可能太低了。第三，把你出條帶那個(gè)PCR產(chǎn)物再跑一下，看有沒(méi)有條帶了，如果有，看多亮，太亮的話要稀釋的。 |
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8樓2012-12-21 21:52:01
hwchen2000
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