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hwchen2000金蟲 (正式寫手)
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[求助]
RT-PCR高手請(qǐng)進(jìn)
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我現(xiàn)在做RT-PCR多次，只有一次做第二鏈合成電泳后顯示有約1000bp的條帶，但是再也沒(méi)有重復(fù)出來(lái)，所以想請(qǐng)教一下各位高手 RNA模板約1ug 我的PCR引物是 forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3' rewards: 5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3' （小寫為保護(hù)堿基） 請(qǐng)大俠幫我驗(yàn)證這個(gè)引物的退火溫度，我現(xiàn)在是55℃ 求教了��！ |
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 PCR技術(shù) | 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2012-12-22 18:54:18
hwchen2000: 金幣+10 2013-01-02 11:09:17
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hwchen2000: 金幣+10 2013-01-02 11:09:17
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我曾經(jīng)遇到過(guò)與你相同的問(wèn)題，只是你的目的片段比較大，我覺(jué)得最好從以下幾個(gè)方面考慮： 1.首先一定要保證你的RAN的純度和完整性都要好，主要是純度一定要好！這一步是基礎(chǔ)。 2.在做RT的時(shí)候，可以嘗試增大RNA的量，2ug也可以，不過(guò)一定要在冰上進(jìn)行。 3.做PCR這一步的時(shí)候，我覺(jué)得你最好使用快速高保真酶來(lái)擴(kuò)增，可以用PrimeStar這種酶來(lái)擴(kuò)增，可以先擴(kuò)增內(nèi)參看看。這一步我覺(jué)得退火溫度可能不會(huì)是大的問(wèn)題，主要是酶，體系最好是25ul，不要用50ul的體系。 4.如果一直沒(méi)有結(jié)果的話，沒(méi)有辦法，只有從頭再做，保證每一步都是可信的，然后再往下做。 |
hwchen20007樓2012-12-21 20:34:51
zhaodahe
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2樓2012-12-18 12:27:32
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3樓2012-12-18 12:32:59
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4樓2012-12-18 12:56:11
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