 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 1623 | 回復(fù): 10 | ||||
hwchen2000金蟲 (正式寫手)
|
[求助]
RT-PCR高手請進(jìn)
|
|||
|
我現(xiàn)在做RT-PCR多次，只有一次做第二鏈合成電泳后顯示有約1000bp的條帶，但是再也沒有重復(fù)出來，所以想請教一下各位高手 RNA模板約1ug 我的PCR引物是 forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3' rewards: 5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3' （小寫為保護(hù)堿基） 請大俠幫我驗(yàn)證這個引物的退火溫度，我現(xiàn)在是55℃ 求教了��！ |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 PCR技術(shù) | 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有195人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 最近RT-PCR能夠出來內(nèi)參，卻沒有目的條帶，請各位高手幫忙
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 有關(guān)RT-PCR模板RNA量的問題，請高手解答！�。�
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 請教PCR高手，使用SYBR Green I法進(jìn)行熒光定量PCR對于產(chǎn)物大小有什么要求？
已經(jīng)有21人回復(fù)
- 著急！RT-PCR擴(kuò)增效率低，情況很詭異，求助高手幫忙指點(diǎn)
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 高手看看我提取的RNA可以進(jìn)行RT-PCR嗎
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 做rt-pcr花錢多不多
已經(jīng)有19人回復(fù)
- rt-pcr圖，請大神們幫助分析一下，急。。。謝謝。。。
已經(jīng)有20人回復(fù)
- c語言高手請進(jìn)
已經(jīng)有35人回復(fù)
- 請教RNA提取高手：反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR)中DNA的去除
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 求高手指點(diǎn)：RT-PCR的引物設(shè)計
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 求助高手 有關(guān)RT-PCR
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 高手幫忙分析下RT-PCR電泳圖
已經(jīng)有3人回復(fù)
- PCR高手請進(jìn)，小女子有事相求，我剛來金幣不要嫌少啊，我只有這么多啊，全給你了
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 向RTPCR高手求助，關(guān)于RTPCR的空白對照問題
已經(jīng)有9人回復(fù)
- Endnote高手請進(jìn)
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助】有機(jī)高手請進(jìn)-合成反應(yīng)解釋
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 【求助】紅外高手請進(jìn)
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 【求助/交流】大家來討論下RT-PCR的試劑盒吧！
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 【求助/交流】Real time RT-PCR 引物設(shè)計問題（高懸賞請高手幫忙）
已經(jīng)有28人回復(fù)
牧歌ping
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 17 (小學(xué)生)
- 金幣: 444.1
- 帖子: 81
- 在線: 13.5小時
- 蟲號: 1497135
- 注冊: 2011-11-17
- 專業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 感謝應(yīng)助！ 2012-12-22 18:53:44
hwchen2000: 金幣+5, ★有幫助 2013-01-02 11:08:40
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 感謝應(yīng)助！ 2012-12-22 18:53:44
hwchen2000: 金幣+5, ★有幫助 2013-01-02 11:08:40
|
RT-PCR即反轉(zhuǎn)錄PCR，需要注意的有以下幾點(diǎn)： 1、首先看RNA是否完整，一般RNA電泳檢測，28S的亮度約是18S的兩倍，說明RNA完整，否則會含有其他RNA，比如mRNA，會影響后續(xù)逆轉(zhuǎn)； 2、我們做逆轉(zhuǎn)一般用的是Takara的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，逆轉(zhuǎn)效果還不錯吧。先看你逆轉(zhuǎn)時RNA加的量是否合適，過小或過高都影響逆轉(zhuǎn)效果，再看你逆轉(zhuǎn)的過程是不是有差錯； 3、逆轉(zhuǎn)為cDNA后，先用其他常用基因檢測下cDNA的質(zhì)量，比如先擴(kuò)增actin，一般這個退火溫度是確定的，如果結(jié)果好再擴(kuò)增你的目的基因，至少說明模板沒問題； 4、能擴(kuò)出actin基因而擴(kuò)不出你的目的基因，可以做退火溫度梯度，一般我們用這個引物設(shè)計軟件http://www.sigma-genosys.com/calc/DNAcalc.asp 測出的退火溫度-5度都能PCR出結(jié)果，除非上下游引物退火溫度差距太大 希望對你能有幫助！ |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
hwchen20005樓2012-12-18 17:26:04
zhaodahe
木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 220 (大學(xué)生)
- 金幣: 1796.6
- 紅花: 7
- 帖子: 461
- 在線: 378.5小時
- 蟲號: 552612
- 注冊: 2008-04-30
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物遺傳學(xué)
2樓2012-12-18 12:27:32
hwchen2000
金蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1950.5
- 帖子: 444
- 在線: 89.7小時
- 蟲號: 216162
- 注冊: 2006-03-11
- 專業(yè): 生物化學(xué)與分子生物學(xué)
3樓2012-12-18 12:32:59
zhaodahe
木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 220 (大學(xué)生)
- 金幣: 1796.6
- 紅花: 7
- 帖子: 461
- 在線: 378.5小時
- 蟲號: 552612
- 注冊: 2008-04-30
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物遺傳學(xué)
4樓2012-12-18 12:56:11
hwchen2000
金蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1950.5
- 帖子: 444
- 在線: 89.7小時
- 蟲號: 216162
- 注冊: 2006-03-11
- 專業(yè): 生物化學(xué)與分子生物學(xué)
6樓2012-12-21 13:38:56
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金幣+2, 鼓勵交流！ 2012-12-22 18:54:18
hwchen2000: 金幣+10 2013-01-02 11:09:17
gyesang: 金幣+2, 鼓勵交流！ 2012-12-22 18:54:18
hwchen2000: 金幣+10 2013-01-02 11:09:17
|
我曾經(jīng)遇到過與你相同的問題，只是你的目的片段比較大，我覺得最好從以下幾個方面考慮： 1.首先一定要保證你的RAN的純度和完整性都要好，主要是純度一定要好！這一步是基礎(chǔ)。 2.在做RT的時候，可以嘗試增大RNA的量，2ug也可以，不過一定要在冰上進(jìn)行。 3.做PCR這一步的時候，我覺得你最好使用快速高保真酶來擴(kuò)增，可以用PrimeStar這種酶來擴(kuò)增，可以先擴(kuò)增內(nèi)參看看。這一步我覺得退火溫度可能不會是大的問題，主要是酶，體系最好是25ul，不要用50ul的體系。 4.如果一直沒有結(jié)果的話，沒有辦法，只有從頭再做，保證每一步都是可信的，然后再往下做。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
7樓2012-12-21 20:34:51
wangqi20092
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 22 (小學(xué)生)
- 金幣: 202.1
- 紅花: 1
- 帖子: 55
- 在線: 12.6小時
- 蟲號: 997780
- 注冊: 2010-04-15
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
hwchen2000: 金幣+5 2013-01-02 11:10:17
hwchen2000: 金幣+5 2013-01-02 11:10:17
| 1000bp根本不算大！第一用內(nèi)參基因擴(kuò)一下 ，確認(rèn)模版能用，也確認(rèn)你的PCR所有試劑能用。第二退火溫度用三倍GC+2倍的AT算一下，我感覺退火溫度可能太低了。第三，把你出條帶那個PCR產(chǎn)物再跑一下，看有沒有條帶了，如果有，看多亮，太亮的話要稀釋的。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
8樓2012-12-21 21:52:01
hwchen2000
金蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1950.5
- 帖子: 444
- 在線: 89.7小時
- 蟲號: 216162
- 注冊: 2006-03-11
- 專業(yè): 生物化學(xué)與分子生物學(xué)
9樓2012-12-25 10:06:30
hwchen2000
金蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1950.5
- 帖子: 444
- 在線: 89.7小時
- 蟲號: 216162
- 注冊: 2006-03-11
- 專業(yè): 生物化學(xué)與分子生物學(xué)
10樓2012-12-25 10:08:18
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 hwchen2000 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +4 | △小透明* 2026-03-17 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 312求調(diào)劑 +4 | 陌宸希 2026-03-16 | 5/250 |
|
|
[考研] 08工科 320總分 求調(diào)劑 +4 | 梨花珞晚風(fēng) 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自動化所實(shí)習(xí) +6 | Losir 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料與化工304求B區(qū)調(diào)劑 +7 | 邱gl 2026-03-11 | 8/400 |
|
|
|
[考研]
 11408 一志愿西電，277分求調(diào)劑
+3
|
zhouzhen654 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 機(jī)械專碩325，尋找調(diào)劑院校 +3 | y9999 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[文學(xué)芳草園] 伙伴們，祝我生日快樂吧 +17 | myrtle 2026-03-10 | 26/1300 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +5 | 素年祭語 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703一志愿211 285分求調(diào)劑 +5 | ly3471z 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿華中師范071000，325求調(diào)劑 +6 | RuitingC 2026-03-12 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 331求調(diào)劑（0703有機(jī)化學(xué) +5 | ZY-05 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 341求調(diào)劑 +4 | 番茄頭--- 2026-03-10 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑（材料與化工327） +4 | 愛吃香菜啦 2026-03-11 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料與化工085600調(diào)劑求老師收留 +9 | jiaanl 2026-03-11 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 材料專碩350 求調(diào)劑 +4 | 王金科 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 工科278分求調(diào)劑 +5 | 周慢熱啊 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 290求調(diào)劑 +7 | ADT 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +3 | 152697 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 大連大學(xué)化學(xué)專業(yè)研究生調(diào)劑 +3 | 琪久. 2026-03-10 | 8/400 |
|