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[求助]
目的基因連接到克隆載體后提取質(zhì)粒測序，序列有問題
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| 蟲友們幫幫忙，我以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，之后連接到T載體上，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，但是幾個菌落酶切后的目的基因片段大小有點(diǎn)差別，有750bp的，有700bp左右的，還有650bp左右的。我就將這三個都拿去測序，結(jié)果750bp的是我要的序列，但是另外兩個稍微短一些的序列也是我的序列，只不過中間分別少了十幾個和二十幾個氨基酸，其它的氨基酸序列都與正確的序列是一樣的。怎么會發(fā)生這種情況呢？難道在大腸桿菌中發(fā)生剪接了，剪掉了一些氨基酸？有蟲友碰到過這種情況嗎？ |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 重復(fù)序列PCR擴(kuò)增 |
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shujunru
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3樓2012-12-20 05:59:59
gyesang
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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首先，指出你描述問題的錯誤的地方， “只不過中間分別少了十幾個和二十幾個氨基酸，其它的氨基酸序列都與正確的序列是一樣的�！边@里不是氨基酸序列，你描述的應(yīng)該是核苷酸序列 “難道在大腸桿菌中發(fā)生剪接了，剪掉了一些氨基酸？”這里同樣應(yīng)是核苷酸序列。 “有750bp的，有700bp左右的，還有650bp左右的”，“結(jié)果750bp的是我要的序列，但是另外兩個稍微短一些的序列也是我的序列，只不過中間分別少了十幾個和二十幾個氨基酸，其它的氨基酸序列都與正確的序列是一樣的�！� 據(jù)你描述這三個質(zhì)粒應(yīng)該都是你的引物擴(kuò)增出來的，但有兩個出現(xiàn)了兩個質(zhì)粒中間缺少一段序列的情況，我覺得你的序列中可能存在重復(fù)序列，然后PCR后，會少一個重復(fù)，你分析下你的序列，看看是不是我說的這種情況，也就是找下你的序列中有沒有一段是重復(fù)序列。 |
2樓2012-12-19 23:25:09
cicelyzh
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4樓2012-12-20 09:22:13
5樓2012-12-20 20:20:05
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