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thinkerboy鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
怎么確定變性和退火溫度
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我反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后，以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，該怎么設(shè)置循環(huán)條件，需要94℃預(yù)變性么退火溫度怎么確定，我用的是invitrogen合成的引物，它給了兩個(gè)退火溫度，一個(gè)是1M Na+ 的TM為66.5和67.9值，另一個(gè)是50mM Na+的TM為44.9和46.3值，這該怎么確定他的退火溫度。 [ Last edited by thinkerboy on 2013-1-2 at 22:54 ] |
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2樓2013-01-02 23:26:23
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| 以cDNA為模板的PCR和普通用genomic DNA的PCR是差不多的，所以預(yù)變性是要做的。如果只是合成了cDNA的第一條鏈的話，長(zhǎng)度不會(huì)特別長(zhǎng)，所以模板的復(fù)雜性相對(duì)下降。至于引物的Tm，和模板的關(guān)系更不大了，是要是完全匹配的模板，只和引物的序列有關(guān)。計(jì)算引物的Tm值有多種方法，結(jié)果也稍微有些區(qū)別。引物通常是在很大一定的溫度范圍內(nèi)都可以擴(kuò)增，只是對(duì)特異性和擴(kuò)增效率有些不同。最佳的退火溫度需要自己實(shí)驗(yàn)摸索。 |
3樓2013-01-03 06:54:01
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