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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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ljw0931

金蟲 (小有名氣)

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[交流] SSR引物退火溫度如何確定，求助！

1、PCR反應(yīng)體系：
Template DNA （50ng/ul） 1ul
Taq                                     0.2ul
dNTPs                               2ul
10 Buffer                            2ul
Primer F                            1ul
      R                            1ul
ddH2O                               12.8ul
2、梯度PCR    grade 46/58度
3、圖片是兩個樣品DNA、3對引物在梯度PCR下的擴增。其中，第一排從左向右，緊接著第二排從左向右，中間是Marker DL 2000，分別用藍、綠、粉表示不同的3對引物在8個溫度梯度下的擴增效果。

問題：
1、請問這3對引物的最佳退火溫度是多少？
2、3對引物中那一對擴增多態(tài)性更好？
3、有什么需要改進的地方？
謝謝！

YINWU001001.JPG

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1樓 2012-08-30 22:52:08

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chenguestc

木蟲 (職業(yè)作家)

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ljw0931(金幣+1): 謝謝參與
1949stone: 金幣+3, 如果是熒光標記檢測問題就不大如果不是您的建議很中肯 2012-08-31 07:18:49

1，個人感覺你的引物濃度偏高了，因為幾乎所有反應(yīng)都有引物二聚體，請減少引物用量。
2，第二對引物請減少上樣量，因為那條帶是引物二聚體還是擴增產(chǎn)物，比較第2對和第三對引物似乎又像是擴增產(chǎn)物。。。
3，第一對引物，48度就不錯。第二對引物，不好說。第三對引物，請?zhí)岣咭稽c退火溫度再看，雖然帶紋不少，但是感覺非特異的應(yīng)該居多。

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2樓2012-08-31 07:09:47

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ZOEY21

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ljw0931(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流 2012-09-01 15:37:14

引用回帖:

2樓: Originally posted by chenguestc at 2012-08-31 07:09:47
1，個人感覺你的引物濃度偏高了，因為幾乎所有反應(yīng)都有引物二聚體，請減少引物用量。
2，第二對引物請減少上樣量，因為那條帶是引物二聚體還是擴增產(chǎn)物，比較第2對和第三對引物似乎又像是擴增產(chǎn)物。。。
3，第一對 ...

我以為SSR產(chǎn)物一般在100~300bp間有單一條帶。你在擴增前應(yīng)該大概知道產(chǎn)物大小，比對marker就知道是否引物二聚體。從圖上看，粉色引物在58度下特異性好一些，雜帶較少，可以在適當提高退火溫度。第二對引物我覺得像擴增產(chǎn)物，高退火挺好。第一對不知是條件不對還是引物不好，都有二聚體。
如果SSR檢測多態(tài)性瓊脂糖不太可能吧，可以熒光標記或者跑聚丙烯酰胺凝膠電泳。

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3樓2012-08-31 08:59:08

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wu_shiyong

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵交流 2012-09-01 15:37:23

引物加一半就好啦！
其實SSR去追求最適退火溫度意義不是很大，我做過很多SSR，一般溫度都是56度用，只有在有的特異性非常不好的引物才提高溫度，這樣感覺才明顯，大多引物提高退火溫度差異并不明顯！
還有不知你的群體多大，而且SSR相對片段較小，建議你別跑瓊脂糖的膠用PAGE。你是怎么讀帶的？如果你群體很大特異引物也比較多，瓊脂糖會很累的！用熒光標記的話多態(tài)性不好的引物分析數(shù)據(jù)時得人為的去掉非特異的帶，而且數(shù)據(jù)不直觀，用PAGE統(tǒng)計時是很直觀的，是否是特異條帶很好看出，這樣統(tǒng)計過后可以直接輸入電腦用軟件分析，熒光的話你還得一個一個看！而且有的引物特異條帶并非是主帶而是附帶，當然你的物種是2倍體的話這種情況會很少的！

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4樓2012-08-31 09:15:27

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chenguestc

木蟲 (職業(yè)作家)

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流 2012-09-01 15:37:35

引用回帖:

3樓: Originally posted by ZOEY21 at 2012-08-31 08:59:08
我以為SSR產(chǎn)物一般在100~300bp間有單一條帶。你在擴增前應(yīng)該大概知道產(chǎn)物大小，比對marker就知道是否引物二聚體。從圖上看，粉色引物在58度下特異性好一些，雜帶較少，可以在適當提高退火溫度。第二對引物我覺得像 ...

SSR一般在100-300是沒錯的，但是物種不同，分子量也不盡相同，我做的物種很多都是在80左右的。如果低于100很難說明到底是引物二具體還是擴增產(chǎn)物。
其次，如果沒有開發(fā)SSR引物的物種用其他物種的引物來做，是不知道具體產(chǎn)物大小的。此外，瓊脂糖可以用來檢測，只是靈敏度低而已。
丙烯酰胺膠是個好建議，但是要看具體差異大小占擴增片段的比例，例如我做過80bp左右的，兩個物種差1個bp，可以分開。但是產(chǎn)物300bp，差3個bp就無法分辨。因而，用熒光標記用測序儀來做時最好的選擇。

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5樓2012-08-31 09:47:36

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ZOEY21

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引用回帖:

5樓: Originally posted by chenguestc at 2012-08-31 09:47:36
SSR一般在100-300是沒錯的，但是物種不同，分子量也不盡相同，我做的物種很多都是在80左右的。如果低于100很難說明到底是引物二具體還是擴增產(chǎn)物。
其次，如果沒有開發(fā)SSR引物的物種用其他物種的引物來做，是不知 ...

多謝！借樓主的帖子受教了！具體問題具體分析，大意大意了...

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6樓2012-08-31 12:28:14

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謝謝，請問用熒光標記效果怎么樣，哪里有相關(guān)參考資料！

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7樓2012-08-31 12:54:17

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chenguestc

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★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖

引用回帖:

7樓: Originally posted by ljw0931 at 2012-08-31 12:54:17
謝謝，請問用熒光標記效果怎么樣，哪里有相關(guān)參考資料！...

這個一般用測序儀來做，我沒見相關(guān)參考資料，如果你們有測序儀可以看下它的說明書�；蛘呔W(wǎng)上你可以索索一下是否有相關(guān)資料。

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8樓2012-08-31 14:37:07

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將引物濃度減半后，結(jié)果是一樣的，除了類似二聚體的產(chǎn)物外，沒有其他擴增產(chǎn)物！

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9樓2012-08-31 21:49:56

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引用回帖:

9樓: Originally posted by ljw0931 at 2012-08-31 21:49:56
將引物濃度減半后，結(jié)果是一樣的，除了類似二聚體的產(chǎn)物外，沒有其他擴增產(chǎn)物！

引物減少只能讓引物二聚體減少或者消失，不會有別的效果的。

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10樓2012-09-03 10:53:41

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