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[交流]
SSR引物退火溫度如何確定，求助！
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1、PCR反應(yīng)體系： Template DNA （50ng/ul） 1ul Taq 0.2ul dNTPs 2ul 10 Buffer 2ul Primer F 1ul R 1ul ddH2O 12.8ul 2、梯度PCR grade 46/58度 3、圖片是兩個樣品DNA、3對引物在梯度PCR下的擴(kuò)增。其中，第一排從左向右，緊接著第二排從左向右，中間是Marker DL 2000，分別用藍(lán)、綠、粉表示不同的3對引物在8個溫度梯度下的擴(kuò)增效果。 問題： 1、請問這3對引物的最佳退火溫度是多少？ 2、3對引物中那一對擴(kuò)增多態(tài)性更好？ 3、有什么需要改進(jìn)的地方？ 謝謝！ YINWU001001.JPG |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵交流 2012-09-01 15:37:23
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵交流 2012-09-01 15:37:23
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引物加一半就好啦！ 其實SSR去追求最適退火溫度意義不是很大，我做過很多SSR，一般溫度都是56度用，只有在有的特異性非常不好的引物才提高溫度，這樣感覺才明顯，大多引物提高退火溫度差異并不明顯！ 還有不知你的群體多大，而且SSR相對片段較小，建議你別跑瓊脂糖的膠用PAGE。你是怎么讀帶的？如果你群體很大特異引物也比較多，瓊脂糖會很累的！用熒光標(biāo)記的話多態(tài)性不好的引物分析數(shù)據(jù)時得人為的去掉非特異的帶，而且數(shù)據(jù)不直觀，用PAGE統(tǒng)計時是很直觀的，是否是特異條帶很好看出，這樣統(tǒng)計過后可以直接輸入電腦用軟件分析，熒光的話你還得一個一個看！而且有的引物特異條帶并非是主帶而是附帶，當(dāng)然你的物種是2倍體的話這種情況會很少的！ |
4樓2012-08-31 09:15:27
chenguestc
木蟲 (職業(yè)作家)
- MolEPI: 7
- 應(yīng)助: 576 (博士)
- 貴賓: 0.4
- 金幣: 4526.9
- 帖子: 4708
- 在線: 353.5小時
- 蟲號: 1337860
★ ★ ★ ★
ljw0931(金幣+1): 謝謝參與
1949stone: 金幣+3, 如果是熒光標(biāo)記檢測 問題就不大 如果不是 您的建議很中肯 2012-08-31 07:18:49
ljw0931(金幣+1): 謝謝參與
1949stone: 金幣+3, 如果是熒光標(biāo)記檢測 問題就不大 如果不是 您的建議很中肯 2012-08-31 07:18:49
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1，個人感覺你的引物濃度偏高了，因為幾乎所有反應(yīng)都有引物二聚體，請減少引物用量。 2，第二對引物請減少上樣量，因為那條帶是引物二聚體還是擴(kuò)增產(chǎn)物，比較第2對和第三對引物似乎又像是擴(kuò)增產(chǎn)物。。。 3，第一對引物，48度就不錯。第二對引物，不好說。第三對引物，請?zhí)岣咭稽c退火溫度再看，雖然帶紋不少，但是感覺非特異的應(yīng)該居多。 |
2樓2012-08-31 07:09:47
★ ★ ★
ljw0931(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流 2012-09-01 15:37:14
ljw0931(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流 2012-09-01 15:37:14
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我以為SSR產(chǎn)物一般在100~300bp間有單一條帶。你在擴(kuò)增前應(yīng)該大概知道產(chǎn)物大小，比對marker就知道是否引物二聚體。從圖上看，粉色引物在58度下特異性好一些，雜帶較少，可以在適當(dāng)提高退火溫度。第二對引物我覺得像擴(kuò)增產(chǎn)物，高退火挺好。第一對不知是條件不對還是引物不好，都有二聚體。 如果SSR檢測多態(tài)性瓊脂糖不太可能吧，可以熒光標(biāo)記或者跑聚丙烯酰胺凝膠電泳。 |
3樓2012-08-31 08:59:08
chenguestc
木蟲 (職業(yè)作家)
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流 2012-09-01 15:37:35
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流 2012-09-01 15:37:35
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SSR一般在100-300是沒錯的，但是物種不同，分子量也不盡相同，我做的物種很多都是在80左右的。如果低于100很難說明到底是引物二具體還是擴(kuò)增產(chǎn)物。 其次，如果沒有開發(fā)SSR引物的物種用其他物種的引物來做，是不知道具體產(chǎn)物大小的。此外，瓊脂糖可以用來檢測，只是靈敏度低而已。 丙烯酰胺膠是個好建議，但是要看具體差異大小占擴(kuò)增片段的比例，例如我做過80bp左右的，兩個物種差1個bp，可以分開。但是產(chǎn)物300bp，差3個bp就無法分辨。因而，用熒光標(biāo)記用測序儀來做時最好的選擇。 |
5樓2012-08-31 09:47:36
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