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SSR引物退火溫度如何確定，求助！
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1、PCR反應(yīng)體系： Template DNA （50ng/ul） 1ul Taq 0.2ul dNTPs 2ul 10 Buffer 2ul Primer F 1ul R 1ul ddH2O 12.8ul 2、梯度PCR grade 46/58度 3、圖片是兩個(gè)樣品DNA、3對(duì)引物在梯度PCR下的擴(kuò)增。其中，第一排從左向右，緊接著第二排從左向右，中間是Marker DL 2000，分別用藍(lán)、綠、粉表示不同的3對(duì)引物在8個(gè)溫度梯度下的擴(kuò)增效果。 問(wèn)題： 1、請(qǐng)問(wèn)這3對(duì)引物的最佳退火溫度是多少？ 2、3對(duì)引物中那一對(duì)擴(kuò)增多態(tài)性更好？ 3、有什么需要改進(jìn)的地方？ 謝謝！ YINWU001001.JPG |
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ljw0931(金幣+1): 謝謝參與
1949stone: 金幣+3, 如果是熒光標(biāo)記檢測(cè) 問(wèn)題就不大 如果不是 您的建議很中肯 2012-08-31 07:18:49
ljw0931(金幣+1): 謝謝參與
1949stone: 金幣+3, 如果是熒光標(biāo)記檢測(cè) 問(wèn)題就不大 如果不是 您的建議很中肯 2012-08-31 07:18:49
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1，個(gè)人感覺(jué)你的引物濃度偏高了，因?yàn)閹缀跛蟹磻?yīng)都有引物二聚體，請(qǐng)減少引物用量。 2，第二對(duì)引物請(qǐng)減少上樣量，因?yàn)槟菞l帶是引物二聚體還是擴(kuò)增產(chǎn)物，比較第2對(duì)和第三對(duì)引物似乎又像是擴(kuò)增產(chǎn)物。。。 3，第一對(duì)引物，48度就不錯(cuò)。第二對(duì)引物，不好說(shuō)。第三對(duì)引物，請(qǐng)?zhí)岣咭稽c(diǎn)退火溫度再看，雖然帶紋不少，但是感覺(jué)非特異的應(yīng)該居多。 |
2樓2012-08-31 07:09:47
★ ★ ★
ljw0931(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-09-01 15:37:14
ljw0931(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-09-01 15:37:14
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我以為SSR產(chǎn)物一般在100~300bp間有單一條帶。你在擴(kuò)增前應(yīng)該大概知道產(chǎn)物大小，比對(duì)marker就知道是否引物二聚體。從圖上看，粉色引物在58度下特異性好一些，雜帶較少，可以在適當(dāng)提高退火溫度。第二對(duì)引物我覺(jué)得像擴(kuò)增產(chǎn)物，高退火挺好。第一對(duì)不知是條件不對(duì)還是引物不好，都有二聚體。 如果SSR檢測(cè)多態(tài)性瓊脂糖不太可能吧，可以熒光標(biāo)記或者跑聚丙烯酰胺凝膠電泳。 |
3樓2012-08-31 08:59:08
★ ★ ★ ★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2012-09-01 15:37:23
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2012-09-01 15:37:23
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引物加一半就好啦！ 其實(shí)SSR去追求最適退火溫度意義不是很大，我做過(guò)很多SSR，一般溫度都是56度用，只有在有的特異性非常不好的引物才提高溫度，這樣感覺(jué)才明顯，大多引物提高退火溫度差異并不明顯！ 還有不知你的群體多大，而且SSR相對(duì)片段較小，建議你別跑瓊脂糖的膠用PAGE。你是怎么讀帶的？如果你群體很大特異引物也比較多，瓊脂糖會(huì)很累的！用熒光標(biāo)記的話多態(tài)性不好的引物分析數(shù)據(jù)時(shí)得人為的去掉非特異的帶，而且數(shù)據(jù)不直觀，用PAGE統(tǒng)計(jì)時(shí)是很直觀的，是否是特異條帶很好看出，這樣統(tǒng)計(jì)過(guò)后可以直接輸入電腦用軟件分析，熒光的話你還得一個(gè)一個(gè)看！而且有的引物特異條帶并非是主帶而是附帶，當(dāng)然你的物種是2倍體的話這種情況會(huì)很少的！ |
4樓2012-08-31 09:15:27
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-09-01 15:37:35
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SSR一般在100-300是沒(méi)錯(cuò)的，但是物種不同，分子量也不盡相同，我做的物種很多都是在80左右的。如果低于100很難說(shuō)明到底是引物二具體還是擴(kuò)增產(chǎn)物。 其次，如果沒(méi)有開(kāi)發(fā)SSR引物的物種用其他物種的引物來(lái)做，是不知道具體產(chǎn)物大小的。此外，瓊脂糖可以用來(lái)檢測(cè)，只是靈敏度低而已。 丙烯酰胺膠是個(gè)好建議，但是要看具體差異大小占擴(kuò)增片段的比例，例如我做過(guò)80bp左右的，兩個(gè)物種差1個(gè)bp，可以分開(kāi)。但是產(chǎn)物300bp，差3個(gè)bp就無(wú)法分辨。因而，用熒光標(biāo)記用測(cè)序儀來(lái)做時(shí)最好的選擇。 |
5樓2012-08-31 09:47:36
6樓2012-08-31 12:28:14
7樓2012-08-31 12:54:17
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